【新技术】SMA co-polymer——一种提取膜蛋白的新方法

在这篇protocol中，研究人员提供了一种使用SMA co-polymer的方法，可以将膜蛋白及其周围脂环境一起提取到SMALP（SMA脂质颗粒）中，可使膜蛋白更接近其生理状态。...

膜蛋白在生命活动中有很重要的作用，许多药物结合位点也在膜蛋白上，生物体中大约30%的转录蛋白是膜蛋白，但是高分辨率蛋白结构中只有2%的结构是膜蛋白结构，对膜蛋白结构和功能的研究缺乏进展是学术界的一个重要问题。传统提取膜蛋白的方法关键是使用detergent将目的膜蛋白与其他所有组分分开，现在有很多种试剂可以破坏膜，但是这些试剂将膜破坏的同时也会将蛋白周围的膜完全移除，这会破坏蛋白折叠以及蛋白活性。而且传统方法中单一的detergent无法很好的模拟膜蛋白所在的磷脂双分子层环境，选择detergent也费时费力，缺少统一的解决方法，限制了研究膜蛋白的效率。

在这篇protocol中，研究人员提供了一种使用SMA co-polymer的方法，可以将膜蛋白及其周围脂环境一起提取到SMALP（SMA脂质颗粒）中，可使膜蛋白更接近其生理状态。而且研究人员证明了该方法可以应用于多种表达系统蛋白的提取，如：大肠杆菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母。

SMA是苯乙烯马来酸（styrene maleic acid）的简称，其共聚物（styrene maleic acid co-polymer）可由苯乙烯-马来酸酐共聚物（styrene maleic anhydride co-polymer）合成.（图1）。SMA co-polymer与脂双分子层可以形成SMPLA，SMPLA中心包含一个脂双分子层，外围由环状SMA polymer支撑（图2），疏水性的苯乙烯基团在脂双层的酰基链之间插入，而亲水的马来酸基团面对溶剂，从而可以稳定结构。

文章中介绍的提取膜蛋白方法的主要流程如下：（详细过程请参考原文）

1，使用苯乙烯-马来酸酐共聚物制备苯乙烯-马来酸共聚物。

2，SMA共聚物制备无脂质蛋白纳米颗粒

研究人员发现，SMALP溶解膜蛋白的下游表征往往需要控制样品以protein-free SMALP的形式同时含有脂质和SMA。当SMA共聚物加入脂质悬浮液时，溶液从混浊溶液变成透明溶液（图3）。SMA与脂质双分子层的相互作用，自组装成SMALPS（图2）3，分离SMALP膜蛋白

此步在蛋白上加上亲和标签很重要，文中建议在membrane-spanning region加上亲和标签，当膜蛋白包裹在SMALPs中被纯化出后，可像球状蛋白一样纯化。大约1g SMA可以用来纯化10g膜(湿重)。

4，纯化SMALP蛋白以及SDS-PAGE分析和浓度测量

（a）分子筛Superdex 200 Increase 10/300 column峰图，上样250 μl；（b）SDS-PAGE检测蛋白样品，从左到右分别为marker，IMAC step得到的过表达膜组分ZipA，SEC step得到的SMALP–ZipA，单独的2.5% (wt/vol) SMA。通过这些实验结果可以看到得到了纯度较高的蛋白，实验详情及其他功能实验，如CD spectroscopy对蛋白折叠以及二级结构测定的详细内容见原文。

当然这种方法也是有限制的，比如提取的蛋白不能大于400kDa；以及SMA polymer只能在pH大约为6.5时形成SMALPs，所以对于提取最适pH值不为6.5的蛋白会有影响；而且高浓度的二价阳离子会导致SMALPs的损坏（例如：大于5 mM），这意味着一些结合核苷酸的蛋白，例如ABC transporters和ATPases不适用于此种方法。当然在做此类蛋白的分析实验时，加入的核苷酸会远高于所需浓度，如果想使用SMALP方法，可以在保持蛋白活性或者酶反应可以顺利进行的基础上适当降低核苷酸浓度以保护SMALP。

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文献名称：1. A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment.

2. Functional reconstitution of human equilibrative nucleoside transporter-1 into styrene maleic acid co-polymer lipid particles.

3. Tuning the size of styrene-maleic acid copolymer-lipid nanoparticles.

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