Nature methods丨基于Nanopore的direct RNA测序方法测评，你要不要来试试？

 

本周一，Nature Methods在线发表Oxford Nanopore direct RNA测序技术测评文章，结果表明，【不经反转、无须扩增的RNA直接测序】能获得全长的链特异性RNA，无测序偏好性，并同时记录碱基修饰，为后续研究基因结构和基因表达，提供新技术新方法。

- direct RNA建库测序-

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提取样本RNA（该实验样本为酵母Saccharomyces cerevisiae），在建库时先后加上poly(T) 接头和测序接头，于Oxford Nanopore测序仪上机测序（该研究中试剂版本：R9.4，测序机型：MinION。未来组以更新款GridION X5机型搭建测序平台，通量更高、base calling更快）

- 测序“raw data”展示-

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Fig.2 展示的是一段带接头序列的~1500-nt的转录本通过测序纳米孔时记录下的电流变化。可以看出测序的顺序是：接头序列→poly(A)→转录本主体。随后对电流变化进行算法识别，重构转录本序列。

当一条转录本完全经过后，纳米孔又重归开放状态，可以迎接下一条RNA的到来。

- 对direct RNA测序进行测评-

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-1. 与参考转录组数据比对-

构建3个数据集：direct RNA在Nanopore测序；反转成cDNA用Nanopore测序；反转成cDNA用Illumina测序。

将测序reads比对到酵母参考转录组，比对情况如下：

-2. 三个数据集之间两两比对-

随后，对三个数据集对同一条转录本的reads支持情况进行了比较，结果显示相关度很高。

-3. 对参考基因组覆盖度的评估-

将direct RNA 和 Illumina cDNA测序reads比对到参考基因组上，计算reads对基因的比对情况和覆盖度（Fig.4），direct RNA比对上的reads数量为2,045,748 (63.43%)；Illumina RNA-seq reads比上的数量为708,592,030 (98.22%)。direct RNA 和 Illumina cDNA测序reads在对基因的覆盖方面，相关度很高（Spearman’s rho = 0.73，Fig.5）。







Fig.5 direct RNA和Illumina cDNA测序，支持每个基因所对应的reads数相关性比较

（n = 6,692 genes）

-4. 对基因识别准确度的评估-

该研究以酵母中的两个同工酶GAPDH基因为例，它们位于基因组不同的位置，编码同一个酶的不同形式，其编码序列有95.8%是完全相同的，仅有42个不同位点的碱基差异。基于以往二代测序是很难将短reads准确地mapping回参考基因组的。而在direct RNA测序中，该区域每条reads能覆盖这42个差异碱基中的大部分，即便有少量位点读取错误，也不影响将reads准确地mapping到对应的基因（Fig.6）。

-5. 实验可重复性的评估-

另外还对同一个样本构建了5个不同的文库分别上机测序，技术学重复结果相关性高（Spearman’s rho = 0.94–0.96; n = 6,713 transcripts），表明文库构建和上机测序实验重复性好。

-6. 测序偏好性的评估-

文章利用外源标准ERCC样品(The External RNA Control Consortium)评估预期和实际的测序读长及测序丰度，结果显示高度的一致性，Spearman’s rho = 0.93, P = 1.9 × 10−40, n = 92 ERCC transcripts（Fig.7a），说明direct RNA测序对转录本的长度没有偏好性。Fig.7b、c评估了对ERCC RNA的覆盖完整度，大部分reads对转录本的覆盖完整度都接近1.0，说明direct RNA测序大部分reads都是测的转录本全长。从Fig.7c还可以看出，direct RNA获得的是链特异性的RNA序列，这对进一步准确获得基因结构及基因表达信息有重要的意义。

-7. 碱基修饰直接识别-

Direct RNA测序能在读取RNA碱基序列的同时获得碱基修饰信息。Fig.8以两种常见的碱基修饰m6A和5-mc为例，展示了经过修饰的碱基与未经过修饰的碱基，在经过测序纳米孔时引起的电流变化有什么区别。

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不经反转、无须扩增的RNA直接测序能获得全长的链特异性RNA，无测序偏好性，并同时记录碱基修饰，为后续研究基因结构和基因表达，提供新技术新方法。