NBT丨Y染色体着丝粒序列解析完成的一小步，人类基因组完成图历史上的一大步

Nanopore 多变应用带来的无限可能...





随着测序技术的进步，数十年来人类基因组的研究得到了长足的发展，耗费的人力物力不断下降，组装的连续性和完整度不断提升，但仍有不少区域未得到充分解析，例如着丝粒、端粒等串联重复序列，这些区域往往被认为与细胞分裂、细胞周期、疾病等密切相关。



2018年3月，Nature Biotechnology 在线发表了一篇通过对BAC文库进行纳米孔（Oxford Nanopore）长读长测序，绘制人类Y染色体着丝粒区域线性DNA序列的方法学文章，解析了该区域长达数百kb的串联重复，不仅有助于了解着丝粒的进化和功能，更是为通过单分子测序的方法实现人类基因组完成图提供一种新思路。

1. 建库测序

对目标区域（人Y染色体着丝粒DYZ3区）的环形BAC (https://bacpacresources.org/)使用转座子酶进行1次打断，形成线性DNA后加上测序接头，在Oxford Nanopore MiniION平台进行全长BAC DNA测序（R9.4，RAD002）。

2. 数据产出

每个BAC run产出数据读长分布见Fig.2, 从10个BAC文库（8个目标位点，2个对照）中，获得了＞3500条全长1D reads。每个BAC产出的总数据量、全长比例和一致性序列长度见Table 1。



3. consensus、polishing和定位、定向

通过评估对照组的数据得知原始1D数据单碱基准确度为84.8%。经过一步consensus和polishing后得到高准确度的一致性序列（Fig.3 B、C），将全长reads比对到每个BAC的consensus reads，对照组准确度为99.2%，其它BAC为99.4–99.8%。



在前一步提高序列准确度后，使用Illumina MiSeq对BAC进行了resequencing，实施了2种变异检测：（1）K-mer method和（2）Alignment metod （Fig.3 D），通过变异检测结果帮助对BAC序列进行定位和排序，例如Fig.3 D右侧圈图以209 kb 长的RP11-718M18示例，使用8个BAC-polished序列，按照从p-arm到q-arm的顺序拼接完整的该区段的序列。

4. 组装结果

从8个BAC的Nanopore测序数据中，组装出了完整的人类Y染色体着丝粒区域：365Kb的α-卫星DNA序列。它包含着一段由5.8Kb的序列串联重复而形成的长达301Kb的特殊序列（Fig.4），包含52个higher order repeats（HOR），其中有7段6.0Kb长的HOR结构变异（Fig.4 紫色）。能通过4种常见的单核苷酸多样性而划分形成的9种单体型（Fig.5）。至此，人类Y染色体着丝粒区域DNA序列得到完整解析。



5. 进一步研究着丝粒的进化和功能

研究人员后续对人类和其它一些类人猿种类的Y染色体着丝粒区域进行了荧光原位杂交（FISH）比对分析（Fig.6）、组蛋白表观修饰分析（Fig.7）等，以期更深入研究着丝粒的进化和功能。

研究人员在这篇论文中实现了利用BAC+Nanopore测序的方法获得完整的人类Y染色体着丝粒DNA序列（串联重复卫星DNA），比以往的研究更完整、更精细，对序列的顺序好和方向有了更准确的判断，为进一步研究着丝粒的进化和功能以及实现人类基因组完成图提供一种新思路，这也是Nanopore多变应用策略的一个体现。

         

参考文献

[1]Jain M, Olsen H E, Turner D J, et al. Linear assembly of a human centromere on the Y chromosome[J]. Nature biotechnology, 2018.

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