文献解读：新生命，锌起点 --缺锌抑制p53泛素化导致神经管缺陷
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我们身边的朋友如果在备孕或者已经怀孕，常被医生告知要服用叶酸，因为它对防止新生儿神经系统畸形有很大帮助，这一点已被大众熟知并认可，因此叶酸作为一种营养补剂在市场上销售量非常可观。一个新生命的诞生对于一个家庭来说是一种新希望，尤其中国父母更是望子成龙、望女成凤，谁都不愿意让孩子输在起点上，但是最近，来自美国科罗拉多大学的Lee Niswander告诉我们若不注意，还真可能让孩子输在“锌”起点上，他发现了缺锌也会导致神经管发育畸形。并且在著名杂志《Development》上发表了题为“锌缺乏通过降低p53泛素化导致神经管畸形”的文章[1]。该研究首次在分子水平上揭示了锌缺乏引起神经管畸形的具体机制，该成果提出的“锌—p53泛素化”非常支持王福俤团队2017年发表在《美国科学院学报》（PNAS）重要发现[2]，并引用了王福俤团队《PANAS》上发表的论文。
《Development》论文首页
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王福俤团队2017年《PNAS》成果，在国际上通过敲除小鼠模型发现Slc39a10为首个巨噬细胞锌离子转运蛋白。在炎性状态下，Slc39a10敲除的巨噬细胞的由于缺乏锌离子，导致p53蛋白稳定性升高，从而诱发巨噬细胞凋亡。进一步通过Slc39a10和p53的巨噬细胞双敲小鼠验证了Slc39a10敲除小鼠巨噬细胞凋亡表型是依赖于p53蛋白的。该成果将“锌—p53蛋白稳定”机制建立起来，阐明了Slc39a10介导锌转运并调控巨噬细胞凋亡的分子机制[2]。
王福俤团队2017《PNAS》论文首页
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流行病学报告显示：在土耳其、伊朗、中国、孟加拉、墨西哥和印度等地区，母亲或胎儿缺锌与神经管畸形的发生相关，并且这种疾病可以通过补锌降低其发生率。神经管发育畸形作为新生儿出生缺陷的第二大类疾病，威胁着众多新生儿健康，也影响着无数家庭的幸福。因此作者探明缺锌与神经管发育缺陷的具体原因对人类健康与幸福有重大意义。
首先作者在宫外培养了小鼠胚胎，且实验组用锌离子螯合剂TPEN使小鼠胚胎处于缺锌状态。结果作者发现，未做处理的对照组小鼠胚胎能够正常闭合神经管（如下图1-A，白色线表示神经管张开的面积，最终闭合），而处于严重缺锌状态的小鼠全部不能正常闭合神经管（如下图1-C，红色线表示神经管张开的面积，最终未闭合），见图1。
同时出现头颅与卵黄囊的缩小现象（如图2），甚至在在中脑和后脑区域似乎有大量的坏死组织。见图2。
作者进一步通过活体成像技术发现缺锌小鼠的神经管上出现大量表示凋亡信号的标志物TUNEL（图3-A红色）和cleaved caspase 3（图3-B绿色），蓝色表示小鼠胚胎神经管。其中神经外胚层的凋亡信号最高，表明神经外胚层对于缺锌刺激最为敏感。并且这种凋亡增加可以通过补锌缓解。
（图3）
同时，作者也用神经上皮细胞验证了缺锌会导致神经上皮细胞出现更多的凋亡现象，加了螯合剂TPEN小鼠神经上皮细胞会出现更多的凋亡信号cleaved caspase 3（图4第二排绿色信号增加），并且补通过充锌可以减少凋亡的发生（图4第三排绿色信号减少）。综上说明缺锌导致神经管闭合障碍是由于过度凋亡引发的。
P53蛋白作为一种细胞生存的调控者之一，作者推测P53可能对缺锌神经管凋亡进程有影响。实验表明确实如此：缺锌小鼠胚胎头部的P53水平明显上升，同时体外实验中缺锌小鼠神经上皮细胞内也出现P53上调现象。如果P53在神经管凋亡起主要作用，那么当去除P53这个因素，细胞是否会减少凋亡呢？于是作者用了一种敲除P53的神经上皮细胞（NE-4C细胞），发现缺锌细胞和对照组凋亡信号竟然几乎相同，再往细胞转入质粒使其表达P53后，凋亡信号又上升，这些证据强有力的表明P53在神经管细胞凋亡中起到关键作用。那P53为何会在缺锌状态下表达上升呢？根据以往的研究表明：泛素化在蛋白质的代谢、功能、调节和降解中都起着十分重要的作用，而P53泛素化是由P53的E3泛素化连接酶Mdm2和去泛素化酶Hausp同时决定的（如图5）。相当于Mdm2促进P53泛素化，进而使P53降解而Hausp的作用相反，两者共同维持P53的稳态。
作者首先发现缺锌神经上皮细胞内的p53泛素化水平要比对照组低，通过补锌又可以提高p53的泛素化水平。提示神经管细胞内p53在缺锌后上调是由于其泛素化水平降低导致的。Mdm2在体内有两种形式，一种是完整的结构，另一种在Caps3存在的情况下被截成更短的结构（缩短体缺少RING结构域）。作者发现在缺锌状态下，p53与缩短体的结合没有改变，但是与其全长蛋白的结合显著下调，因此提示p53泛素化水平降低是p53与RING结构域结合降低的结果。为了证明这一点作者又在神经上皮细胞中过表达p53的另外一种泛素化E3连接酶CHIP,这种酶的显著特点之一是不需要锌离子参与其功能，结果发现CHIP可以降低细胞在缺锌环境下的凋亡水平。综上所述，p53上升是由于Mdm2的RING结构因缺锌而不能正常与p53结合，进而导致p53泛素化水平降低，最终引起神经管闭合过程中细胞过度凋亡。因为p53在促进细胞凋亡方面具有双重功能:一是作为转录因子调节凋亡相关靶基因;另一种是直接与抗凋亡的Bcl2/Bcl-xl蛋白结合，释放促凋亡的线粒体Bax，作者为了探索清楚是P53具体以哪种形式导致神经管细胞凋亡，于是针对两种机制分别用了对应的抑制剂pifithrin-α（p53转录活性的抑制剂）和pifithrin-μ（抑制p53线粒体通路和HSP70），最后表明p53转录活性增高是缺锌环境下导致神经管畸形发生的主要途径，并且在p53转录调控的下游促凋亡基因Fas1和Bax有显著上升。最后作者用一张清晰的模式图（图6）总结此项研究：在正常的神经管闭合过程中，锌水平足够时，p53与Mdm2完美结合，Mdm2调节p53水平，维持细胞存活，抑制细胞死亡。而缺锌状态下，Mdm2的RING结构域因缺少锌而不能与p53完美契合，从而降低泛素化水平，进而增加了P53的稳定性，使其在核内积累增加与转录活性增加，从而促进细胞大量凋亡最终导致不能形成一个封闭的神经管。
（图6）
这项研究首次揭示微量元素锌对胎儿神经管发育的重要性，给临床营养尤其是孕期营养提供了新的参考与指导。因此我们提醒正在备孕或怀孕的准妈妈们做到饮食全面，保证各种营养素比例的平衡。最后附上《2016中国居民膳食指南》对于孕妇在一般人群膳食基础上增加的五条关键推荐：1. 补充叶酸，常吃含铁丰富的食物，选用碘盐。
2. 孕吐严重者，可少量多餐，保证摄入含必要碳水化合物的食物。
3. 孕中晚期适量增加奶、鱼、禽、蛋、瘦肉的摄入。
4.适量身体运动，维持孕期适量增重。
5.禁烟酒，愉快孕育新生命，积极准备母乳喂养。
参考文献：
（1）Huili Li#, Jing Zhang and Lee Niswander*. Zinc deficiency causes neural tube defectsthrough attenuation of p53 ubiquitylation. Development. 2018 Dec13;145(24).doi:10.1242/dev.169797.PMID: 30545932
（2）Hong Gao#, Lu Zhao#, Hao Wang,Enjun Xie, Xinhui Wang, Qian Wu, Yingying Yu, Xuyan He, Hongbin Ji, LotharRink, Junxia Min* and Fudi Wang*.The Metal Transporter Slc39a10Regulates Susceptibility to Inflammatory Stimuli by Controlling MacrophageSurvival. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA.2017 Dec5;114(49):12940-12945. doi: 10.1073/pnas.1708018114. PMID: 29180421
第/一/作/者盛健，男，2018级硕士研究生，江苏常州人。导师为赵璐副教授，在王福俤教授实验室主要开展锌与造血发育及其机制研究。
编辑：林蕾
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