专家聊文献临床组学系列之一：口腔蛋白组学和宏蛋白组学研究

此研究对唾液蛋白组进行了快速、深度的定量分析，为宿主和病菌互作以及临床唾液诊断提供了基础。...

导读

口腔中不仅有多样性的微生物种群，也是病原菌的入口之一。口腔的稳态由唾液进行维持。因此，唾液分泌的变化以及口腔微生物种群组成的变化会导致许多疾病。此研究对唾液蛋白组进行了快速、深度的定量分析，为宿主和病菌互作以及临床唾液诊断提供了基础。

唾液蛋白组的深度定量

研究者们使用临床常用的棉签从四位男性及四位女性受试者中收集唾液。富集蛋白后，直接进行酶切，脱盐，预分离，质谱分析，得到的数据使用MaxQuant及Perseus进行分析(Fig. 1)。

Fig. 1 唾液蛋白组深度定量分析流程

在八位受试者中总共鉴定了54000条肽段以及5000+蛋白。其中78%的蛋白在所有受试者中都有鉴定到，90%的蛋白在至少六位受试者中鉴定到。而只有1.3%的蛋白是单个受试者独有的(Fig. 2a)。即使是单个受试者，也鉴定了5213个蛋白。而且在所有蛋白中，丰度最高的15个蛋白只占蛋白总量的32%，而在血浆和尿液中这个比例可达90%和58%(Fig. 2b)，这是唾液蛋白质鉴定数目如此高的原因之一。所鉴定蛋白的绝对丰度横跨6个数量级，其生物学功能注释如图所示(Fig. 2c)。除了唾液，研究者还将受试者的血浆蛋白组进行了定量分析，发现在两种体液中都鉴定到的蛋白之间的丰度值几乎没有相关性(R2=0.11;Fig. 2d)。由此可以得出唾液并不能成为血浆蛋白水平的替代物。

Fig. 2 8位健康受试者的唾液蛋白组深度研究

群组研究中的唾液蛋白组的动态变化

接下来作者对8位受试者的两种状态 - 睡醒后及餐后刷牙后的唾液蛋白组进行研究。PCA分析结果中，成分1可以按性别对所有样本进行部分分离，而成分2可以按照上述两种状态显著地分离各个样本(Fig. 3a)。为研究PCA分布相关蛋白，研究者根据蛋白质丰度变化比例以及差异显著性进行差异蛋白质筛选(Fig. 3b)，结果显示睡醒后显著上调蛋白多与“抗菌”及“抗微生物”相关，餐后上调蛋白多与“硫醇蛋白酶抑制”和“分泌”相关。

Fig. 3 人唾液蛋白组的日内动态变化

人类唾液中微生物蛋白组的鉴定

因为口腔微生物对人类健康和疾病有着很大的影响，研究者们对唾液样本中的微生物种类进行了鉴定。而由于亲缘关系较近的细菌通常共享许多肽段序列，研究者将鉴定到的肽段置于一个分类树上，这样所有共享的肽段即可在每个分枝上表示出来(Fig. 4)。这个在门的水平上进行的微生物分类既可以保证肽段的鉴定和定量结果的可靠性，又无需使用过于严格的标准来鉴定细菌蛋白。

Fig. 4 50个细菌种属的分类树

微生物蛋白的存在是否干扰人源性蛋白定量结果的准确性呢？在本研究中，人和细菌共享的包含7个氨基酸以上的肽段只有0.043%(Fig. 5a)。因此，微生物蛋白对人源性蛋白的影响可以忽略。此外，与目前主流的MAILDI-TOF鉴定微生物的流程相比，shotgun蛋白组的方法足以直接覆盖棉签上的所有细菌蛋白。

口腔定量宏蛋白组

研究中同时鉴定到了如此多的蛋白让研究者可以同时对微生物和人源性蛋白进行定量分析。鉴定到的人类蛋白有4000+，因此在所有6197个蛋白中，有至少三分之一的蛋白来自于微生物(Fig. 5b)。为了避免高估微生物蛋白质的丰度差异，研究者使用强度最高的10条（TOP 10）肽段的丰度之和来表征蛋白质的含量。借此，研究者们得出了丰度排名在前20个（Top 20）的微生物种类(Fig. 5c)。与16S RNA测序结果一致，链球菌是丰度最高的微生物。而排名前十位的微生物其丰度差异并不明显。当把蛋白组的结果与人、微生物组的二代测序结果对比时，PCA分析显示二者具有高度的一致性。表明口腔微生物组在个体中的差异并不明显(Fig. 5d)。

Fig. 5 微生物蛋白的定量分布

宏蛋白组的差异性和动态性

在不同受试者之间，微生物种类十分相似(R2=0.82;Fig. 6a)。而在所有受试者中，每个人的TOP 8的微生物的蛋白累积绝对丰度却有很大的差异(Fig. 6b)，但相对丰度差异却相对较小(Fig. 6c)。当把男女受试者分别进行累加的时候，两组的微生物丰度却十分相似且正相关(R2=0.94;Fig. 6d)。相反，在吃完早饭和刷牙之后，微生物丰度有着明显的变化。高丰度微生物的含量降低2.5倍而低丰度微生物降低趋势更明显(Fig. 6e, f)。

Fig. 6 不同受试者中以及时间点的微生物组成

本研究在人类唾液中一共鉴定到了超过5500个蛋白质以及超过50种微生物，且结果显示鉴定到的蛋白质与NGS之间的定量结果一致性非常高，提示蛋白质组学可以作为微生物鉴定的一个有效补充手段，而且应用蛋白质组学对微生物进行鉴定，无需对微生物进行扩增培养，速度快，效率高。作者提出蛋白质组学是目前唯一可以在系统层面研究免疫系统与致病微生物之间相互关系的有效技术手段。

原文献：

Grassl, N., et al. (2016). "Ultra-deep and quantitative saliva proteome reveals dynamics of the oral microbiome." Genome Med 8(1): 44.