你不知道的实验技巧篇：分子生物学实验小技巧集锦（一）

平时实验没有做成功，不一定是设计方案有问题，而往往是由于操作上面的不认真，或是一些小小的细节没有注意到。以下...

平时实验没有做成功，不一定是设计方案有问题，而往往是由于操作上面的不认真，或是一些小小的细节没有注意到。以下是集各路朋友的一些经验，与大家分享（注意：实验需要靠自己摸索，下面的经验如果对你有启发的，切记先小试验证）：

1. 提取质粒的时候，最后一步的酒精挥发很关键，基本上是其后续的酶切反应的决定性因素。所以这一步尽量挥发长一点时间，最好是空调吹热风，或是37度温箱放长一点的时间，我试过室温过夜，酶切很好。

2. 有关缓冲液和培养基配置
1）将缓冲液配方中的成分分别以10－100倍配成母液储存，需要的时候只需将相应的母液混合，补加水稀释即可
2）配培养基时通常会忘记各成分的量，如配LB时的三个成分不记得到底哪个是5g，哪个要10个，因此可以在常用的试剂瓶的标签上注明所需的量，如配LB时，在NaCl瓶外注明10g/L,yeast 5 g/L, tryton 10 g/L等，很方便，不需要每次配之前临时翻书。

3. 有关PCR主反应液配置:
在做克隆鉴定的时候经常需要在酶切鉴定前进行PCR鉴定，每次配置PCR反应液很繁琐，可以将其配置类似kit的形式，按你需要的反应体系列表，然后放大100倍配置100×主反应液（100次反应），其中含buffer，Mg2＋，dNTPs，但不含引物和Taq酶，然后可以10×分装或一管储存在－20度，在需要的时候拿出融开，然后按所需的PCR反应个数吸取相应的倍数，再补加相应反应倍数的Taq和引物，混匀后分装，这样做的好处如下：
1）可极大的节省宝贵的时间，可早点收工，看球
2）避免每次反应加样不均的可能
3）大大减少PCR假阳性的产生

4. 有关酶切反应液的配置:
在做酶切时，也可以像PCR一样配置主反应液，每次反应前先列好反应的体系，算好需要的反应数，然后按所需反应的体系按所需反应数放大，加入buffer、酶、水；质粒栏空缺，然后混合后按除质粒DNA的体积分装，然后再在每管中加入相应体积的质粒DNA酶切，这样做的好处如下，特别是当同时有10几个阳性克隆需要鉴定时尤为明显：
1）各反应成分均一
2）可大大减少限制型内切酶的使用
3）节省时间

5. 做大肠表达时确定蛋白是否表达一般要煮样做诱前诱后检测,但很多时候煮出来的很黏影响跑胶效果.我发现如果先用8MUrea重悬细菌再煮效果会有极大改善.
注:不能用Gu-HCl代替

6. 超滤最合适用于蛋白的浓缩，更换缓冲液和除盐，对于按照分子量进行初分离的效果不是很好，理论和现实是有很大差别的^_^

7. 我们有时要沉淀东西时，由于沉淀量很少，离心完之后不知道到底有没沉淀下来东西，所以离心时建议按特定的方向放置离心管（比如EP管盖放同一方向），这样你就可以在离心之前确定沉淀的大致部位。另外看沉淀时可以对光看，这样就是颗粒状的细小沉淀也能看见的。

8. 大家都知道PMSF有剧毒，以前都是知道浓度和要配的体积的基础上,算出要称多少毫克的PMSF,其实也可以先称PMSF,称多少算多少,再调整异丙醇的体积，到达你所要的浓度。这样就避免了你长时间和它接触。（就是说让你改变溶剂体积，配合质量，使最终浓度不变）

9. 在用酶标板加样的时候，蛋白样品常常会产生很多气泡，如果做荧光实验，由于灵敏度非常高，一点点微小的气泡都会影响很大，常常又不可能加消泡剂，我就用卫生纸，撕下来一小条，搓成小针，碰一碰气泡就破了，很好使。（管家哥提示也可以准备一个小针头，打火机稍微加热，碰一下气泡即破，一般一次加热可以搓好几个。如果体系可以离心，就瞬间离心下最好）

10. 酶切或者PCR体系混合好以后，大家都会用手指轻弹EP管的底部来混匀溶液，常常出现很多气泡。这时候轻弹液面上方的管壁，消除气泡就轻而易举了。千万别弹液面下方的，气泡会越来越多。

11. 磁珠回收时，不要贪多，收集上层即可，太过影响DNA的纯度和质量，对链接、转化有影响。

12. 各种buffer都要完全融化后才能用，而且不管什么药品，如果只剩下最后一点底子了，最好放弃，因为可能会影响你的实验。

13. 动手前，一定要思路清晰，尽量把要做的事情列出来。

14. 做前一定要在笔记上写上1、2、3.....，在按照笔记一步一步做，否则容易出错。（管家哥想说这点师弟师妹应该做的很好的吧，哈哈）

15. 要加的酶阿，dNTP，水啊之类的能分装的话最好分装好一点，万一污染的话就全完了。（管家哥提醒这点非常重要）

16. 制备好了一批感受态，最好马上转化一种已知质粒，与此同时，取一点感受态接种到含抗性的固/液体培养基培养来做对照。这样第二天即可以知道这批感受态是否还有外源质粒，又可以知道这批感受态转化效率的高低。如果合格，那以后就可以放心使用！

17. 做克隆挑斑时，我们可以在将沾有菌体的牙签丢到试管前，在一块相应抗性的平板上点一下，标注清楚，培养时间稍长一点，待长成较大菌落后收取。以后需要哪一个菌,就在平板上挑取。这样既方便快捷，又可以保证菌的一致。

18. 抽提质粒时，加入SloutionII和III后要求轻柔混匀。我个人觉得不用这样，只要不是非常剧烈，可以快速混匀。尤其可以运用在一次抽提多管质粒的时候，这样可以快速，而且效果一点也不差。

19. 抽提质粒时，用无水乙醇沉淀的时间可以由实验操作者来决定，如果时间充裕可以30min，否则8-10min也可以。至于温度，个人觉得-20度好于常温。如果加入可醋酸钠，会较容易形成盐类杂质，所以时间短一些更好！

20. 不知道大家都是怎么做酶切的，我的体会是，酶切质粒时，两个酶分别单酶切比直接双酶切效果要好很多（管家哥提醒这个要视不同体系而定）。我有一次双酶切两次都没连出来，后来分步单酶切，连接效率几乎100%。
可以第一个酶切完后直接把体系热失活，（根据酶说明书上一般是65度20min）然后直接向里面补第二个酶
或者第一个切完后用氯仿抽提，把蛋白提出
或者中间做一次回收，这个就要考虑回收效率和损失的问题了，但是这样除蛋白最彻底

21. 任何试剂反复冻融对其效率都有很大地影响。所以买来的试剂第一次使用时要注意按每次实验用量分装保存。提取的模板或纯化的样品也最好分装保存，以备不测。

    关注 生物科研帮