PD-1和CAR-T各有千秋，联用会怎么样？

我有一个大胆的想法：PD-1阻断+CAR-T联用...

本文系生物谷原创编译，欢迎分享，转载须授权！鉴于CAR-T细胞免疫疗法和PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂都存在各自的缺陷：

CAR-T细胞需要PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂在肿瘤微环境中抵抗免疫抑制。

而PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂需要在肿瘤微环境中有足够的肿瘤特异性T细胞。

一种有前景的方法就是将这两类免疫疗法结合起来，发挥1+1≥2的效果， 极大地提高治疗人类肿瘤的疗效。

同时降低药物的毒副作用，从而让患者从中受益。

CAR-T疗法的优点和缺陷

CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。

该疗法是一种出现了很多年，但近几年才被改良使用到临床中的新型细胞疗法。

在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。

近年来，CAR-T免疫疗法除了被用来治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤之外。

经改进后，也有望用来治疗实体瘤、自身免疫疾病、HIV感染和移植排斥等疾病，具有更广阔的应用空间。

正如所有的技术一样，CAR-T技术也经历一个漫长的演化过程，正是在这一系列的演化过程中，CAR-T技术逐渐走向成熟。

这种新的治疗策略的关键之处在于构建一种被称作嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）的人工受体来特异性地识别在癌细胞表面上表达的抗原。

如B细胞恶性肿瘤的CD19、CD20和CD22，胶质母细胞瘤的EGFRRVIII。

CAR由一段胞外单链抗原可变区片段（scFV）、跨膜区和胞内信号区3个部分组成。

第一代CAR将scFV区与激活抗原特异性T细胞的CD3ζ胞内信号区连接。

之后，开发的CAR包含了额外的共刺激信号（CD28、4-1BB和OX40，第二代CAR包含其中的一个，第三代CAR包含其中的两个）来增强和维持T细胞功效。

然而，患者的T细胞本身并不表达这种CAR，毕竟它是一种人工受体，是特异性地针对癌细胞表面上存在的抗原人工设计出来的。

在人体临床试验中，科学家们通过一种类似透析的过程提取出病人体内的一些T细胞。

在实验室对它们进行基因修饰，将编码这种CAR的基因导入，这样这些T细胞就能够表达这种新的受体，如图1所示。

这些经过基因修饰的T细胞在实验室进行增殖，随后将它们灌注回病人体内。

这些T细胞利用它们表达的CAR受体特异性地结合癌细胞表面上的抗原上，从而触发一系列信号转导事件。

最终强效地摧毁体内的癌细胞。

CAR-T细胞免疫疗法尽管在治疗血液肿瘤中有巨大的希望，但是同时也存在较大的副作用。

CAR-T细胞免疫疗法带来一个巨大的临床风险就是细胞因子风暴。

当CAR-T细胞快速杀死癌细胞时，产生的大量细胞因子会对宿主其他组织器官发起惊人的攻击，导致高烧、低压、休克甚至死亡。

此外，血液肿瘤仅是癌症中的一小部分。

作为癌症中的大头，实体瘤远比血液肿瘤复杂得多。

尽管初步研究已表明CAR-T细胞免疫疗法在实体瘤方面具有不错的安全性和有效性。

但是接受治疗的患者也会出现败血症、气短和白细胞水平升高等副作用。

对实体瘤的治疗似乎并没有想象中的那么乐观。

免疫检查点抑制剂疗法的优点和缺陷

在正常情况下，为了阻止活化的T细胞破坏正常的人体细胞，免疫系统能够通过激活PD-1/PD-L1等免疫检查点来控制T细胞的活化进程。

防止出现T细胞错误地攻击正常的细胞。

然而，癌细胞通过表达表面蛋白PD-L1特异性地识别T细胞表面上的PD-1，窃取这种控制机制。

从而激活免疫检查点来抑制T细胞的免疫活性，这就会导致癌细胞逃避免疫识别和茁壮生长，如图2所示。

这就为癌症治疗开创了全新的免疫治疗思路——通过免疫检查点抑制剂阻断CTLA-4或PD-1等免疫检查点。

阻止癌细胞窃取这种控制机制，从而释放免疫系统自身的能力来攻击癌症。免疫检查点抑制剂治疗通过抑制免疫检查点活性，释放肿瘤微环境中的免疫刹车，重新激活T 细胞对肿瘤的免疫应答效应。

从而达到抗肿瘤的作用。PD-1的天然配体有两个，分别为PD-L1和PD-L2。

目前研究和应用最广泛的免疫检查点抑制剂之一就是PD-1 /PD-L1 的抑制剂，如图3所示。目前，实际上只有约20%～40%的患者能够从PD-1/PD-L1抑制剂治疗中获益。

两个重要因素是免疫抑制性的肿瘤微环境中缺乏肿瘤特异性T细胞和T细胞经历功能性耗竭。

两类免疫疗法联用的进展和前景

近年来，科学家们在CAR-T细胞免疫疗法和PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂联用方面不断取得进展。

让我们一起看看这个领域取得的最新进展。

2018年8月，Sarwish Rafiq等人构建出两类新型CAR-T细胞：一类靶向在某些血癌细胞中表达的CD19抗原。

另一类靶向在某些卵巢癌和胰腺癌等实体瘤中表达的MUC16抗原。

接着，通过基因改造，将一种抗PD-1抗体的简化版本---单链抗体可变区片段（scFv）---的编码基因导入到已经构建好的 CAR-T 细胞中。

这样经过基因改造后的CAR-T 细胞就能够分泌scFv[1]，如图4所示。

他们发现在实体瘤和血癌的多种小鼠模型中，这两类新型CAR-T细胞在体内存留时间更长，疗效更好。

更重要的是，由于免疫检查点抑制剂scFv在癌症附近释放，它们能够激活癌症附近的T细胞。

从而招募患者自身的T细胞一起来杀伤癌症。

再者，血液中具有很低的scFv水平，这表明这种免疫检查点抑制剂没有扩散到离癌症很远的地方。

这样就能够降低全身性的副作用。

2017年2月，Nan Chen等人通过基因工程技术构建了CAR-T细胞过表达PD-1显性阴性受体（DNR, 缺乏PD-1跨膜区和胞内信号区的PD-1受体）。

实验结果确实表明：

与单纯的M28z CAR-T细胞相比，表达PD-1 DNR的M28z CAR-T细胞（第二代CAR-T 细胞中的一种）在遭受重复抗原刺激下，具有改善的增值能力、细胞毒性和细胞因子分泌[2]。

实体瘤小鼠模型实验也表明：

表达PD-1 DNR的M28z CAR-T细胞能更好控制肿瘤负荷和延长中位生存期。

不过，一些小鼠在使用单剂量的表达PD-1 DNR的M28z CAR-T细胞后出现了肿瘤复发。

2017年，胥阶英构建出靶向EGFR家族成员并且高水平稳定表达抗PD-1抗体的Herin CAR-T细胞。

实验结果表明当进行共培养时，表达表达抗PD-1抗体的Herin CAR-T细胞能够更有效地杀伤肺癌细胞株NCI-H1299、NCI-H460、NCI-H23和H446。

在NCI-H460小鼠移植瘤模型中，分泌PD-1抗体的CAR-T细胞能够在小鼠体内更好地增殖和更有效地抑制肿瘤的生长[3]。

2017年4月，Wendell Lim及其团队以慢病毒为载体运送CRISPR/Cas9编码基因。

从而构建出缺乏PD-1的anti-CD19 CAR-T细胞，如图5所示。

这种PD-1破坏增强了CAR-T细胞介导的体外肿瘤细胞杀伤并增强了清除体内PD-L1阳性肿瘤异种移植物的效果。

这就为利用精确基因组工程改进下一代细胞疗法铺平了道路[4]。

2016年7月，Leonid Cherkassky等人利用胸膜间皮瘤的原位小鼠模型发现：

肿瘤微环境中的PD-1上调会抑制基于CD28和4-1BB共刺激的第二代CAR-T细胞的功能。

然而，通过抗PD-1抗体、细胞内源性PD-1 shRNA阻断或PD-1显性负性受体（PD-1 DNR）阻断干扰PD-1/PD-L1通路能够恢复CAR-T细胞的效应功能[5]。

这表明阻断PD-1/PD-L1可能是一种改善CAR-T细胞免疫疗法疗效的有效策略。

2018年1月，Kite制药公司（Kite Pharma）公布一项名为ZUMA-6的I/II期临床试验结果（NCT02926833）。

证明了它的anti-CD19 CAR-T细胞产品Yescarta （axi-cel）联合罗氏的PD-L1抑制剂Tecentriq治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者安全有效[6]。

总体有效率（ORR）为89%（n = 8/9），其中完全缓解率（CR）为56%（n = 5/9）。

除了提起的Kite制药公司和罗氏之间共同开展的CAR-T与PD-L1联合用药的临床试验之外。

Juno治疗公司（Juno Therapeutics）也与阿斯利康达成了合作协议。

共同推进它的在研CAR-T细胞产品JCAR014联合后者的PD-L1抑制剂Durvalumab治疗非霍奇金淋巴瘤的临床试验（NCT02706405）。

当前，CAR-T细胞免疫治疗技术的一个不足之处在于灌注到患者体内后，T细胞倾向于变成“耗竭（exhausted）”状态。

相比于对抗疾病的功能性T细胞，耗竭T细胞的一个比较明显的区别是它们能够表达PD-1。

2016年12月，鉴于Nicholas Haining及其团队发现在慢性病毒感染的小鼠中，不同于能够有效对抗感染或癌症的T细胞的是：

耗竭T细胞受一组不同的分子通路控制。

他们还发现借助于CRISPR/Cas9技术剔除一段促进PD-1产生的耗竭特异性增强子，会降低PD-1表达。

这就为改善CAR-T细胞免疫疗法提供了可能[7]。

与此同时，Haining团队在另一项研究中发现阻断PD-1使得耗竭T细胞短暂地获得了功能性T细胞的功能。

但是在表观遗传学方面很大程度上仍然是未改变了，这表明阻断PD-1带来的益处来自于耗竭T细胞的短暂活化。

而不是它们在耗竭状态上的永久性改变[8]。

2017年2月，Elise Chong等人报道了一个病例：

一名患有难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）和进展性淋巴瘤的患者在接受靶向CD19的CAR-T细胞免疫疗法后接受抗PD-1抗体治疗。

结果这名患者具有临床显著的抗肿瘤反应。

CAR-T细胞发生增殖和降低这些T细胞中的PD-1和 Eomes共表达[9]。

这个病例表明抗PD-1抗体可有效治疗对CAR-T细胞免疫疗法不作出反应的癌症。

2016年6月，Tessa Gargett等人构建出靶向GD2的第三代CAR-T细胞。

并发现体外培养时，在遭受重复抗原刺激下，CAR-T细胞发生显著的激活诱导细胞死亡（activation-induced cell death, AICD）。

而PD-1阻断可增加CAR-T细胞存活，促进它们杀灭PD-L1阳性的黑色素瘤细胞系[10]。

他们在治疗转移性黑色素瘤时，评估了CAR-T细胞在参与I期临床试验CARPETS的患者中的持久性 。

这些数据表明PD-1靶向组合治疗方法可能用于增强CAR-T细胞的疗效和在患者体内的持久性。

2013年10月，Liza John等人构建出靶向Her-2的CAR-T细胞。

在Her-2转基因受者小鼠的过继转移研究中，在接受靶向Her-2的CAR-T细胞与抗PD-1抗体组合治疗后。

对两种不同Her-2阳性肿瘤的生长抑制得到显著改善。

这种改善与CAR-T细胞的功能增强（其特征就是更高的胞内IFNγ表达）存在关联[11][12]，如图6所示。

他们还在接受这种组合治疗的小鼠的肿瘤微环境中观察到：

Gr1+ CD11b+髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell）所占的比例显著下降。

这种组合疗法不会导致这些小鼠出现自身免疫反应。

2017年3月，Inna Serganova等人构建出靶向人前列腺特异性膜抗原（hPSMA）的人CAR -T细胞。

在Myc-CaP前列腺瘤小鼠模型中证实相比于单独使用过继性CAR -T细胞免疫疗法时，CAR -T细胞免疫疗法与抗PD-1单抗联用可增强CAR -T细胞的疗效。

不过，这种治疗反应持续时间相对较短，这提示着其他的免疫调节机制限制着CAR -T细胞在小鼠前列腺瘤中的功能和持久存在[13]。

迄今为止，科学家们利用CAR-T细胞免疫疗法和PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂开展组合治疗的研究并不多见。

以上列出的一些研究是其中的典型代表。

目前的这种组合治疗仅局限在细胞模型和动物模型上。

或者虽然已开展人体临床试验。仍然停留在I期期临床试验阶段。

参与临床试验的患者人数仍然偏少，仍需通过招募更多的患者人数来开展II期和III期临床试验。

最终，能否得到各国监管机构的批准，仍是未知数。

未来，随着科学家们不断取得新的突破，这种组合治疗有望为更多癌症患者带来福音。

参考文献：

1.Sarwish Rafiq et al. Targeted delivery of a PD-1-blocking scFv by CAR-T cells enhances anti-tumor efficacy in vivo. Nature Biotechnology, Published Online: 13 August 2018, doi:10.1038/nbt.4195.

2.Nan Chen et al. CAR T-cell intrinsic PD-1 checkpoint blockade: A two-in-one approach for solid tumor immunotherapy. OncoImmunology, 2017, 6(2), doi:10.1080/2162402X.2016.1273302.

3.胥阶英. 靶向EGFR家族成员分泌PD-1抗体的CAR-T细胞治疗肺癌的实验研究. 浙江理工大学2017年硕士论文.

4.Levi Rupp et al. CRISPR/Cas9-mediated PD-1 disruption enhances anti-tumor efficacy of human chimeric antigen receptor T cells. Scientific Reports, Published online: 07 April 2017, doi:10.1038/s41598-017-00462-8.

5.Leonid Cherkassky et al. Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1 checkpoint blockade resist tumor-mediated inhibition. Journal of Clinical Investigation, First published: 25 July 2016, doi:10.1172/JCI83092.

6. A Study Evaluating KTE-C19 in Combination With Atezolizumab in Subjects With Refractory Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL) (ZUMA-6)

https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02926833?id=ZUMA-6

7.Debattama Sen et al. The epigenetic landscape of T cell exhaustion. Science, 02 Dec 2016, 354(6316):1165-1169.

8.Kristen Pauken et al. Epigenetic stability of exhausted T cells limits durability of reinvigoration by PD-1 blockade. Science, 02 Dec 2016, 354(6316):1160-1165.

9.Elise Chong et al. PD-1 blockade modulates chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells: refueling the CAR. Blood, 23 Feb 2017, 129(8):1039-1041.

10.Tessa Gargett et al. GD2-specific CAR T Cells Undergo Potent Activation and Deletion Following Antigen Encounter but can be Protected From Activation-induced Cell Death by PD-1 Blockade. Molecular Therapy, 1 Jun 2016, 24(6):1135-1149, doi:10.1038/mt.2016.63.

11.Liza John et al. Anti-PD-1 Antibody Therapy Potently Enhances the Eradication of Established Tumors By Gene-Modified T Cells. Clinical Cancer Research, October 2013, 19(20):5636-5646, doi:10.1158/1078-0432.CCR-13-0458.

12.Liza John et al. Blockade of PD-1 immunosuppression boosts CAR T-cell therapy. OncoImmunology, Published online: 10 Oct 2013, doi:10.4161/onci.26286.

13.Inna Serganova et al. Enhancement of PSMA-Directed CAR Adoptive Immunotherapy by PD-1/PD-L1 Blockade. Molecular Therapy Oncolytics, 17 March 2017, 4:41-54, doi: 10.1016/j.omto.2016.11.005.

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