抗体药物偶联物（Antibody-drug conjugate, ADC）的发展（上） 多维海拓行业研究

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1. 概念

抗体药物偶联物（Antibody-drug conjugate, ADC）是通过化学键将具有生物活性的细胞毒药物连接到单克隆抗体（mAb）上，单克隆抗体（mAb）作为载体将细胞毒药物靶向运输到目标细胞中发挥作用的一类药物。

2. 特点

抗体药物偶联物（Antibody-drug conjugate, ADC）既具有细胞毒药物杀伤力强大的特点，又结合了重组单克隆抗体（mAb）高度的靶向性，稳定性和有利的药代动力学特征，主要表现为：治疗效力强；特异性高；免疫原性弱，不容易产生抗药性；血清中循环时间长（短于单抗）；对非靶点毒性弱等。

3. 发展历史

早在20世纪初，以“化疗之父”——保罗·埃利希（Paul Ehrlich）为代表的医药学家们提出了“魔术子弹”的推论，旨在寻找一种化合物能够选择性靶向致病有机体而不产生其他副作用。真正意义上的 ADCs 概念诞生于 1958 年，但当时技术比较落后，无论是细胞毒药物的活性、抗体技术还是接头连接技术都不成熟，直到 1975 年，第一个现代版的ADCs 才被报道。随着人源化靶向抗体的开发、细胞毒药物活性的提高、新型接头稳定性以及裂解效率的增强，ADCs的发展也进入黄金时期。

2000年FDA批准首个ADCs的上市产品（商品名Mylotarg，Pfizer研发，用于治疗首次复发、60岁以上、CD33+、不适合细胞毒化疗的急性髓性白血病（AML）患者）。Mylotarg在上市后验证性III期研究中被发现产生严重的致命性肝损伤且未表现出明显的生存获益，辉瑞于2010年主动将其撤市。

但是药学工作者们并未放弃这一极具潜力的技术。在Mylotarg之后又有4个ADCs药物先后获得FDA的上市批准，分别是：武田/Seattle Genetics联合开发的Adcetris（brentuximab vedotin，2011年，用于治疗霍奇金淋巴瘤和系统性间变性大细胞淋巴瘤）；罗氏的Kadcyla（ado-trastuzumab emtansine，2013年，用于治疗HER2阳性乳腺癌）；惠氏/辉瑞的Besponsa（inotuzumab ozogamicin， 2017年，用于单药治疗复发或难治性的CD22+成人B细胞前驱急性淋巴细胞白血病（ALL））。阿斯利康的Lumoxiti（moxetumomab pasudotox-tdfk，2018年，用于治疗至少接受过两次全身治疗、复发或难治性毛细胞白血病（HCL）的成年患者。）并且2017年9月，Mylotarg被FDA批准重新上市，用于治疗新确诊的CD33+成人急性髓性白血病（AML），以及对初始治疗无应答的2岁以上儿童的难治性CD33+急性髓性白血病（AML）。

4. 基本原理

ADCs药物的靶向性来自其中抗体部分（antibody），毒性大部分来自小分子化药毒物部分（payload），抗体部分也可以自带毒性（ADCC与CDC）。抗体部分与毒素部分通过连接物（linker）互相连接。抗体部分与肿瘤细胞表面的靶向抗原结合（binding）后，肿瘤细胞会将ADC内吞（endocytosis）。之后ADC药物会在溶酶体中分解（lysosomal degradation），释放出活性的化药毒物，破坏DNA或阻止肿瘤细胞分裂，起到杀死细胞的作用。理想化的连接物应该保持稳定所以不会导致靶外毒性（off-target toxicity），并且在细胞内高效释放毒物。从ADC技术的基本原理中可以看出该项技术的关键环节包括：靶点筛选、抗体的结构修饰、小分子毒素的选择、连接物的设计和优化。

1. 靶点

靶细胞表面抗原通常会涉及到细胞的正常生长或增殖过程，一般是细胞表面蛋白、糖蛋白或多肽等。理想的抗原靶标应在靶细胞表面大量特异性的表达，而在正常组织或细胞表面表达有限或不表达，同时应具有一定的内吞速率以及有合适的内吞转运途径。目前在开发的ADCs几乎全部覆盖已确证的靶点，靶点的确定也基本决定了ADCs药物的适应指征。

2. 抗体

2.1 抗体的特点

ADC药物对抗体的一般要求，比如：

（1）对肿瘤细胞高表达（或变异）的受体的靶向性；

（2）偶联后能够保留其自身特性；

（3）抗体和抗原间适当的亲和力。

一些体内研究表明高亲和力和内吞速度、降解速率间存在一定矛盾。高亲和力的抗体可以确保毒素在肿瘤细胞内更好的富集，但却具有更快的内吞速率和降解速率，会限制其对肿瘤的渗透力；而低亲和力抗体内吞速率和降解速率慢，在肿瘤细胞表面滞留时间长，能够更有效穿透肿瘤细胞，使抗肿瘤活性更强。在选择抗体时通常会综合考虑肿瘤细胞表面抗原表达的情况和数量、内吞速率以及靶标从细胞膜上脱落等影响ADC活性的因素。

2.2 抗体的类型

主要抗体可以分为4个亚型，其中鼠源单抗（Mouse Mab）作为第一代单克隆抗体由于属于外源蛋白，在人体内清除速率快、半衰期短，容易引起人抗鼠抗体反应，已全部终止用于临床。后来开发的三种抗体，人源成分比例逐代升高，安全性上升的同时也伴随研发成本的提高。

2.3 抗体的修饰

现在为了提高安全性和治疗效果，并便于扩大生产的质量控制，ADCs药物开发企业都会对抗体进行结构改造或修饰。一类是修饰可连接的位点，以控制抗体的连接位置和小分子毒素的连接数量，提高产品的均一性和在血液中的稳定性，控制药物在靶标细胞内的脱离速度。另一类是将抗体糖基化修饰以增强抗体在连接后能够保持其作为单抗时的特性，包括抗体依赖细胞毒性（ADCC）、补体依赖毒性（CDC）等。

2.4 抗体的连接位点

传统的偶联技术由于发生位置、偶联小分子药物个数多而不确定等问题使得所得ADCs药物具有多样性，比例不固定，治疗指数低，并且批次间可重复性差，无法进行精确计量。新一代偶联技术是将小分子药物偶联到抗体上的特定位点以克服以上的缺点。目前应用的位点专一的ADC偶联技术主要有三种：

（1）Thiomab技术，工程化引入半胱氨酸，既不会干扰免疫球蛋白的折叠和组装，也不会改变抗体抗原的结合模式，获得的ADC药物既保留了其体内抗肿瘤活性，还提高了耐受性、降低了系统毒性。

（2）引入非天然氨基酸实现ADC 药物定点偶联的技术。此方法首先合成一个能识别终止密码子的转运RNA（即tRNA），并构建能催化引入的非天然氨基酸连接到tRNA上的氨酰tRNA合成酶，构成氨酰tRNA 合成酶/tRNA 正交对，然后将抗体DNA 序列中的某一个氨基酸的密码子突变成终止密码子，再协同这一正交对，在细胞内或细胞外合成含有非天然氨基酸的抗体。而且引入的非天然氨基酸通常含有叠氮基、酮基、炔基等官能团。

（3）酶催化法，该方法是通过基因工程技术，使抗体中产生能被某些酶识别的相关氨基酸序列，再利用酶对底物的特异性，将其中的特定氨基酸残基进行改造，从而实现定点偶联。目前主要应用转谷氨酰胺酶、糖基转移酶和分选酶A等。

2.5 抗体的内吞

通常抗体的进入细胞的途径有网格蛋白介导的细胞内吞、细胞膜穴样凹陷(小窝)介导的内吞、胞饮作用。第一种被认为是绝大多数ADC发挥药效作用的最重要转运途径。当ADCs通过血液循环到达癌细胞时，与相应靶抗原结合，通过受体介导的细胞内吞作用是ADCs产生预期药效的关键。并不是每种靶点都可以内吞，而且每种抗体-抗原配对的内吞效率并不一样，而内吞效率又决定了ADCs的使用剂量。ADCs的内吞作用主要受到以下几个方面的影响：偶联细胞毒药物、肿瘤表面抗原、抗体与抗原间的亲和力。

3. 小分子毒素

理论上说化疗药物、细胞毒素、放射性核素等对肿瘤细胞具有较大杀伤作用的细胞毒性物质都可以作为 ADCs的毒素进行连接。ADCs连接的毒素通常必须同时具备以下几个特征：

（1）作用机制明确；

（2）细胞毒作用必须极高；

（3）可以被修饰，结构改造后具有可连接基团且生物活性与修饰前相当；

（4）在抗体溶液中稳定存在并充分溶解。

目前临床应用最多的细胞毒药物根据其作用机制可分为两大类：

（1）DNA损伤剂：作用于DNA 的calicheamicin( CLM，属烯二炔类抗菌药物），通过与DNA双螺旋小沟结合，导致DNA 的裂解和细胞死亡。

（2）微管蛋白抑制剂auristatins( MMAE、MMAF) 、maytansinoids ( DM1、DM3、DM4 )。其通过与微管结合阻止微管的聚合，阻滞细胞周期，继而诱导肿瘤细胞凋亡。

微管蛋白抑制剂主要分为两大类一类是海兔毒素及其奥瑞他汀类衍生物auristatins (MMAE、MMAF、MMAD)，一类为美登素及美登素类衍生物maytansinoids ( DM1、DM2、DM3、DM4 )。目前临床在研ADCs项目采用微管蛋白抑制剂的占绝大多数，并且两个子类毒素均有批准上市的产品（Adcetris采用奥瑞他汀类的MMAE，Kadcyla采用美登素衍生物DM1）。

4. 偶联

连接物是连接抗体与细胞毒药物的桥梁。理想的偶联须在体外或血液循环中稳定以防因细胞毒药物的提早释放导致的系统毒性，同时在进入癌细胞后能够快速释放有效细胞毒药物以杀死癌细胞。

4.1 偶联分子

目前使用的连接物按照不同机制主要分为两类，第一类是可裂解连接物，第二类是不可裂解连接物。可裂解连接物有三种不同类型的释放机制：

（1）溶酶体蛋白酶敏感连接物。利用溶酶体蛋白酶，如组织蛋白酶B，识别并裂解一种二肽键，从而从结合物中释放游离药物。

（2）酸敏感连接物。这类连接物的优点是在溶酶体中低pH 环境下，激发连接物内一个酸不稳定基团水解从而释放药物。

（3）谷胱甘肽敏感连接物。这个策略利用细胞内较血液中有较高浓度的硫醇，如谷胱甘肽，连接物内二硫键在血液循环中相对稳定，但在细胞内谷胱甘肽被还原从而释放游离药物。

另外，最近Rakuten Aspyrian公布了其开发的新型光敏ADC技术，是把一种叫做IRDye700DX (IR700)的染料连接到肿瘤特异抗体上，药物分布到肿瘤组织后再用近红外光照射诱导细胞凋亡。使用该技术的主打产品是与EGFR抗体西妥昔单抗偶联的ASP-1929，并正在进行头颈癌的二期临床研究。不可裂解的连接物如硫醚thioethers（含R-S-R），依赖内吞后抗体完全降解，连接物附着一个氨基酸残基从mAb上释放出游离药物。两种连接物分别具有相对的优缺点，采用不可裂解的连接物可以提高ADCs在血液中的稳定性从而具有较高的安全性，可裂解连接物会产生旁观者杀伤（bystander killing又称旁效应），攻击附近的癌症细胞从而具有更强的杀伤效果。可裂解连接物根据连接物的分子大小又可分为小分子连接物和大分子连接物。以小分子连接物进行偶联的ADCs药物，其连接物水溶性差而抗体水溶性好，会导致蛋白聚集产生较大的毒副作用。美国公司Mersana首个使用特定的高分子作为连接物，解决了以上的问题。高分子连接物水溶性好、可生物降解，从而在药效、毒副作用方面体现出了显着优势。目前，我国的诺灵生物医药科技（北京）有限公司打破了Mersana公司对此技术的垄断。4.2 连接物与抗体的偶联方法

偶联方法主要包括非定点偶联和定点偶联。非定点偶联法是早期ADCs研究中使用的方法，是在不对抗体进行改造或修饰的情况下，利用化学方法直接将药物与抗体上氨基酸残基进行偶联，其偶联的小分子毒素个数和偶联位置都不能确定，产生的ADCs差异极大。现在使用的定点偶联技术通常需对抗体进行改造或修饰，提高了ADCs的均一性。实现定点偶联的方法包括使用半胱氨酸突变、非天然氨基酸、硒代半胱氨酸和酶解偶联法等。药品的质量控制向来严格，ADC药物的质量评价对于企业和监管部门都是全新的挑战，因为其不仅是生物制品和化学药品的叠加。DAR比值和药物分布是关键性指标，会直接影响ADCs药物的安全性和有效性。常用的测定方法包括紫外-可见分光光度法（UV）、疏水色谱法（HIC-HPLC）、反相色谱法（RP-HPLC）、质谱法（MS）等。其次，效价、纯度、杂质检测、pH值等也是常见检测要求。

未完…… 

作者：张稼小

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