周末文摘丨RNA 治疗，新药研发的另一种可能
2018 年8 月， 一款独特的小干扰RNA 药物获得FDA 批准，使RNA 治疗再次获得业界关注。FDA 局长在评价该药物时指出，这种新技术可以改变疾病的诱发因子，有可能改变治疗途径，使人类可以更好地面对甚至治愈疾病。...
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编者按
2018 年8 月， 一款独特的小干扰RNA 药物获得FDA 批准，使RNA 治疗再次获得业界关注。FDA 局长在评价该药物时指出，这种新技术可以改变疾病的诱发因子，有可能改变治疗途径，使人类可以更好地面对甚至治愈疾病。本文将概述RNA 治疗的作用机制、应用范围，并探讨其作为药物的获益与风险。
2018 年8 月10 日， 美国食品药品管理局批准首款小干扰核糖核酸（small interfering ribonucleic acid，siRNA） 药物Patisiran， 用于治疗患有遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性病（hereditary transthyretin-mediated amyloidosis，hATTR） 的成年患者[1]， 这使RNA 药物治疗再次获得广泛关注。
其实，近几年有多款反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）RNA 药物取得FDA上市批准， 如Nusinersen、Eteplirsen 和Mipomersen 等。Moderna 公司作为mRNA 药物研发的代表也获得了资本市场的密切关注，迄今已融资逾18 亿美金[2]。
可以说，RNA 治疗正逐步走向市场，并承载厚望。本文将简明介绍RNA 治疗（RNA-based therapeutics）的作用机制及产业前景。
其实，近几年有多款反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）RNA 药物取得FDA上市批准， 如Nusinersen、Eteplirsen 和Mipomersen 等。Moderna 公司作为mRNA 药物研发的代表也获得了资本市场的密切关注，迄今已融资逾18 亿美金[2]。
可以说，RNA 治疗正逐步走向市场，并承载厚望。本文将简明介绍RNA 治疗（RNA-based therapeutics）的作用机制及产业前景。
什么是RNA 治疗？
RNA 治疗是指基于RNA 的靶向治疗手段，药物最终的靶点通常是特定的RNA 序列，或者药物本身就基于RNA 的分子。
常见的RNA 治疗手段按分子类型和作用方式的不同可分为小干扰核糖核酸（smallinterfering RNA，siRNA）、微小核糖核酸（microRNA，miRNA）、反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）、适体（aptamer）和合成信使核糖核酸（synthetic mRNA）[3] 。
RNA 治疗可以作用于靶向人和病毒的转录组、调节基因表达、改变mRNA 剪切、靶向参与转录、以及通过表观遗传学途径调控非编码RNA 和mRNA 等。
图 1 细胞中的各种RNA 分子和作用（图片来源[4]）
图1（原图及说明引用自[4]）中展示了细胞中多种多样的RNA 分子。这些RNA 分子在细胞中有着重要而广泛的作用。除了直接参与蛋白质合成的三种传统类型的RNA（rRNA，tRNA 和mRNA）外，许多小型非编码RNA（ 200 nt）在多种细胞过程中发挥重要作用。这些过程包括染色质重塑（如Xist，HOTAIR）、转录（如asRNA，eRNA）、从细胞核中的RNA 加工（如NATS）到翻译（如-Uchl1）再到蛋白质修饰（如NKILA）。而有毒RNA（如三核苷酸重复）的表达或由RNA 编辑等导致的RNA 突变也可以通过不同的方式引起疾病。
多种的RNA 治疗方案中最常见的机制是通过与目标RNA 进行精确配对（ASO，siRNA）或者非精确配对（miRNA），导致目标RNA 的降解，剪切改变，或者无法正常翻译，最终实现对致病蛋白的控制或者更改[4]。大部分的ASO、siRNA 和miRNA 本质上都是这种作用方式。
文首提到的Nusinersen 就是一款针对脊髓性肌萎缩症患者的单链反义寡核苷酸── ASO 药物。患有脊髓性肌萎缩症的个体存在着突变或缺失的存活运动神经元1（survival motor neuron 1，SMN1）基因，因而不能产生足够的SMN 蛋白来维持运动神经元的存活。低水平的SMN 蛋白最终导致进行性肌肉无力和消瘦（萎缩）。这种病一度无药可救，直到Nusinersen 的出现。Nusinersen 调节SMN1 的同族蛋白SMN2 的剪切位点，在功能上将SMN2 转化为SMN1，从而提高SMN 的蛋白水平，然后提高中枢神经元的活力[5]。
除了调节RNA 的剪切位点，更为常见的作用机制是通过RNA 干扰的方式实现对目标mRNA 的降解，或者阻断其翻译。RNA 干扰是在细胞内自然发生的过程，以阻断某些基因的表达方式。几乎所有的siRNA 和miRNA 以及RNA H 介导型的ASO的作用机制都是基于RNA 干扰[4]。如Alnylam公司的Patisiran、Lonis 公司的Inotersen 和Genzyme 的Mipomersen。虽然这种作用机制很普遍，但这种机制只能用于调节（通常是降低）某个基因的表达量，在药物开发的过程中比较受限。图2（原图及图注引自[4]）展示了每个机制作用的具体方式。
图 2 常见调节基因表达的反义机制。（A-E）反义寡核苷酸杂交后通过两种不同的机制调节基因表达：（1）酶促RNA降解和（2）占位机制。酶促RNA 降解包括（A）类DNA 反义寡核苷酸，其通过RNA 酶H1 触发互补RNA 的切割和（B）siRNA 介导的通过Ago2-RISC 通路减少互补RNA，和其他机制，如核酶降解。占位机制利用反义寡核苷酸与靶RNA 碱基配对使得RNA 不发生降解。这些作用包括但不限于：（C）用非DNA 样反义寡核苷酸调节剪接，以抑制或增强剪接位点的利用;（ D）用非 DNA 样反义寡核苷酸调节 mRNA 翻译，以通过空间阻断 (steric blocking) 抑制翻译或通过与翻译抑制元件结合激活翻译 ;（ E）通过与 miRNA 碱基配对抑制 miRNA 功能或通过与结合有 miRNA绑定位点的mRNA 的位点实现消除特定miRNA 效用的作用（图片来源[4]）
在上市的RNA 药物中，适体的作用方式与其他RNA 分子药物不尽相同。适体是与特定靶分子结合的寡核苷酸或肽分子，又被称为“化学抗体”，在功能上与传统抗体相当，但具有几个优点，包括它们相对小的物理尺寸，具有柔性结构，能够快速通过化学产生，具有多功能化学修饰，高稳定性和缺乏免疫原性[6]。除此之外，适体还可与细胞受体结合后被内化，在核酶组合以及其靶分子存在下自切割，使其成为小干扰RNA（siRNA），微小RNA（microRNA） 和常规药物的有用靶向递送剂[7]。例如，2004 年被FDA 批准 的Pegaptanib 就是一种RNA 适体，由28 个核苷酸组成，治疗新生血管性（湿性）年龄相关性黄斑变性（AMD）[8]。通过特异性结合165VEGF 同种异型体，Pegaptanib 能够控制新血管的形成、增加血管的渗透性，从而治疗这两个主要病理过程导致的新生血管性黄斑变性[9]。
最后一大类RNA 治疗机制是直接引入mRNA，原则上，这种方式能够引入任何蛋白，又不同于基于DNA 的基因治疗那样永久不可变，降低了基因治疗的安全性隐患，有很大的自由度和想象空间。这也是Moderna 这类超高估值公司出现的原因。从用途上，mRNA 有两个非常有吸引力的应用方向，mRNA 疫苗和治疗不可靶向基因病。相对传统蛋白制剂疫苗而言，mRNA 疫苗有潜力将生产时间从数月缩短到数周，有更高的潜在迭代效率。这一特点在面对一些快速进化的流行病时将显现出不同于传统疫苗的随病毒演化能力。除此之外，用mRNA 实现个性化癌症疫苗也显示出一定的可行性[10]。相对mRNA 疫苗而言，将mRNA 用于治疗罕见基因病的技术难度更高。除了要解决递送问题，还要避免免疫原性，控制mRNA 的蛋白翻译效率等。目前，上述技术门槛正在逐一破解，如Moderna Therapeutics 开发了新型氨基脂质体（amino lipids），因增加内体逃逸效率，从而提升了脂质纳米颗粒的mRNA 递送效率[11]。一些引人注目的临床试验正在进行。如，用编码血管内皮生长因子（ vascular endothelial growth factor，VEGF） 的mRNA 产生足够的蛋白来帮助心脏病人患病后修复和维系健康。目前，该研究已进入临床二期试验。 另一个例子是Translate Bio 公司正在研究的用编码囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）来治疗囊性纤维化，旨在细胞内产生完整功能的CFTR 蛋白，从而治愈囊性纤维化。该研究也进入了临床一期。未来，更多的mRNA 治疗方案或将在临床试验中证明其有效性和安全性[12]。
RNA 治疗是指基于RNA 的靶向治疗手段，药物最终的靶点通常是特定的RNA 序列，或者药物本身就基于RNA 的分子。
常见的RNA 治疗手段按分子类型和作用方式的不同可分为小干扰核糖核酸（smallinterfering RNA，siRNA）、微小核糖核酸（microRNA，miRNA）、反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）、适体（aptamer）和合成信使核糖核酸（synthetic mRNA）[3] 。
RNA 治疗可以作用于靶向人和病毒的转录组、调节基因表达、改变mRNA 剪切、靶向参与转录、以及通过表观遗传学途径调控非编码RNA 和mRNA 等。
图 1 细胞中的各种RNA 分子和作用（图片来源[4]）
图1（原图及说明引用自[4]）中展示了细胞中多种多样的RNA 分子。这些RNA 分子在细胞中有着重要而广泛的作用。除了直接参与蛋白质合成的三种传统类型的RNA（rRNA，tRNA 和mRNA）外，许多小型非编码RNA（ 200 nt）在多种细胞过程中发挥重要作用。这些过程包括染色质重塑（如Xist，HOTAIR）、转录（如asRNA，eRNA）、从细胞核中的RNA 加工（如NATS）到翻译（如-Uchl1）再到蛋白质修饰（如NKILA）。而有毒RNA（如三核苷酸重复）的表达或由RNA 编辑等导致的RNA 突变也可以通过不同的方式引起疾病。
多种的RNA 治疗方案中最常见的机制是通过与目标RNA 进行精确配对（ASO，siRNA）或者非精确配对（miRNA），导致目标RNA 的降解，剪切改变，或者无法正常翻译，最终实现对致病蛋白的控制或者更改[4]。大部分的ASO、siRNA 和miRNA 本质上都是这种作用方式。
文首提到的Nusinersen 就是一款针对脊髓性肌萎缩症患者的单链反义寡核苷酸── ASO 药物。患有脊髓性肌萎缩症的个体存在着突变或缺失的存活运动神经元1（survival motor neuron 1，SMN1）基因，因而不能产生足够的SMN 蛋白来维持运动神经元的存活。低水平的SMN 蛋白最终导致进行性肌肉无力和消瘦（萎缩）。这种病一度无药可救，直到Nusinersen 的出现。Nusinersen 调节SMN1 的同族蛋白SMN2 的剪切位点，在功能上将SMN2 转化为SMN1，从而提高SMN 的蛋白水平，然后提高中枢神经元的活力[5]。
除了调节RNA 的剪切位点，更为常见的作用机制是通过RNA 干扰的方式实现对目标mRNA 的降解，或者阻断其翻译。RNA 干扰是在细胞内自然发生的过程，以阻断某些基因的表达方式。几乎所有的siRNA 和miRNA 以及RNA H 介导型的ASO的作用机制都是基于RNA 干扰[4]。如Alnylam公司的Patisiran、Lonis 公司的Inotersen 和Genzyme 的Mipomersen。虽然这种作用机制很普遍，但这种机制只能用于调节（通常是降低）某个基因的表达量，在药物开发的过程中比较受限。图2（原图及图注引自[4]）展示了每个机制作用的具体方式。
图 2 常见调节基因表达的反义机制。（A-E）反义寡核苷酸杂交后通过两种不同的机制调节基因表达：（1）酶促RNA降解和（2）占位机制。酶促RNA 降解包括（A）类DNA 反义寡核苷酸，其通过RNA 酶H1 触发互补RNA 的切割和（B）siRNA 介导的通过Ago2-RISC 通路减少互补RNA，和其他机制，如核酶降解。占位机制利用反义寡核苷酸与靶RNA 碱基配对使得RNA 不发生降解。这些作用包括但不限于：（C）用非DNA 样反义寡核苷酸调节剪接，以抑制或增强剪接位点的利用;（ D）用非 DNA 样反义寡核苷酸调节 mRNA 翻译，以通过空间阻断 (steric blocking) 抑制翻译或通过与翻译抑制元件结合激活翻译 ;（ E）通过与 miRNA 碱基配对抑制 miRNA 功能或通过与结合有 miRNA绑定位点的mRNA 的位点实现消除特定miRNA 效用的作用（图片来源[4]）
在上市的RNA 药物中，适体的作用方式与其他RNA 分子药物不尽相同。适体是与特定靶分子结合的寡核苷酸或肽分子，又被称为“化学抗体”，在功能上与传统抗体相当，但具有几个优点，包括它们相对小的物理尺寸，具有柔性结构，能够快速通过化学产生，具有多功能化学修饰，高稳定性和缺乏免疫原性[6]。除此之外，适体还可与细胞受体结合后被内化，在核酶组合以及其靶分子存在下自切割，使其成为小干扰RNA（siRNA），微小RNA（microRNA） 和常规药物的有用靶向递送剂[7]。例如，2004 年被FDA 批准 的Pegaptanib 就是一种RNA 适体，由28 个核苷酸组成，治疗新生血管性（湿性）年龄相关性黄斑变性（AMD）[8]。通过特异性结合165VEGF 同种异型体，Pegaptanib 能够控制新血管的形成、增加血管的渗透性，从而治疗这两个主要病理过程导致的新生血管性黄斑变性[9]。
最后一大类RNA 治疗机制是直接引入mRNA，原则上，这种方式能够引入任何蛋白，又不同于基于DNA 的基因治疗那样永久不可变，降低了基因治疗的安全性隐患，有很大的自由度和想象空间。这也是Moderna 这类超高估值公司出现的原因。从用途上，mRNA 有两个非常有吸引力的应用方向，mRNA 疫苗和治疗不可靶向基因病。相对传统蛋白制剂疫苗而言，mRNA 疫苗有潜力将生产时间从数月缩短到数周，有更高的潜在迭代效率。这一特点在面对一些快速进化的流行病时将显现出不同于传统疫苗的随病毒演化能力。除此之外，用mRNA 实现个性化癌症疫苗也显示出一定的可行性[10]。相对mRNA 疫苗而言，将mRNA 用于治疗罕见基因病的技术难度更高。除了要解决递送问题，还要避免免疫原性，控制mRNA 的蛋白翻译效率等。目前，上述技术门槛正在逐一破解，如Moderna Therapeutics 开发了新型氨基脂质体（amino lipids），因增加内体逃逸效率，从而提升了脂质纳米颗粒的mRNA 递送效率[11]。一些引人注目的临床试验正在进行。如，用编码血管内皮生长因子（ vascular endothelial growth factor，VEGF） 的mRNA 产生足够的蛋白来帮助心脏病人患病后修复和维系健康。目前，该研究已进入临床二期试验。 另一个例子是Translate Bio 公司正在研究的用编码囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）来治疗囊性纤维化，旨在细胞内产生完整功能的CFTR 蛋白，从而治愈囊性纤维化。该研究也进入了临床一期。未来，更多的mRNA 治疗方案或将在临床试验中证明其有效性和安全性[12]。
RNA 治疗的产业前景
RNA 治疗机制不同于传统的化学合成小分子药物和大分子生物药，也不同于基于DNA 的基因治疗。RNA 治疗将重点放在数量更多、动态变化更丰富、可塑性更强的RNA 上，通过调控或改变传递信息（mRNA），达到影响结果（蛋白质）的目的。由于RNA 治疗的靶向性的选择面更广、理论效率更高和治疗方案的自由度更高，给予了大量研发空间尝试不同的靶向策略及给药方式。大量ASO 神经系统疾病药物研发结果也显示出RNA药物不寻常的药代动力学和药效学特性：包括复杂的活性摄取机制（ uptake mechanisms） ，低全身暴露（systemic exposure），较长的半衰期（half-lives）， 以及从亚细胞贮库（subcellular depots）的逐渐积累、释放[12]。
然而，RNA 治疗的发展并非一帆风顺。举个例子，ASO 互补mRNA 使得RNA 降解的RNA抑制机制早在20 世纪80 年代末90 年代初就被发现、阐述， 但第一款ASO 药物Fomivirsen在1998 年才被FDA 批准用于治疗巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）视网膜炎，其机制为与CMV 复制所必需的 immediate-early-2（IE-2）蛋白的mRNA 结合，从而抑制CMV 复制[13，14]。而后由于治疗方案的改变导致适应证人群骤减，在2002 年就退出市场。 真正意义上的被FDA 批准的、基于反义结合原理（antisense）抑制细胞内mRNA 表达的ASO 药物Mipomersen 更是到2015 才出现[15，16]。而RNA 剪切、外显子跳跃的原理也早在20 世纪90 年代末就被提出，多家公司如Sarepta，Lonis，Biogen 也早早起步，但经过多年的试错，才终于在2016 年出现了首款基于选择剪切原理的药物Eteplirsen 获FDA 批准上市；而概念还相对较新的mRNA 疗法则更是面临着半衰期短、mRNA 免疫原性风险、最大化蛋白质表达、mRNA 的递送等问题[17]。此外，RNA疗法很多的时候不能治愈疾病，但是价格极其高昂，例如引言中提到的Patisiran，每位病人每年花费就高达45 万美金[18]。另外，这些RNA 疗法常常伴随着一定风险的副作用，如ASO 药物常存在血液凝固异常和血小板减少以及肾脏损害等风险[19]。
种种现象，不禁让人们思考，如何评估RNA分子治疗的风险和获益？ RNA 治疗已经在稳定性提高、脱靶性降低、以及靶向药物活性增强等方面取得突破，这与新型寡核酸药物化学分子的发现、递送介质的优化、对于寡核酸药物作用机制的更好理解、以及对与疾病机制的更深入解析密切相关[12]。随着临床试验的开展，人们对于RNA 药物也逐渐形成了更加丰富的认识，发现了RNA 治疗方案有其他药物不可比拟的迭代速度、生产效率和药物学特性。
复杂和多变的背后，既代表着机会，也提示着风险。许多科学家相信，RNA 在生物学中的作用是无限的，因而它的治疗潜力也是无限的。人们不仅可以靶向mRNA，还可以靶向非编码RNA（ncRNA）。NcRNA包括microRNA（ miRNA），以及repetitive RNA，intronic RNA， 和长ncRNAs（lncRNA） ，它们都具有广泛的控制基因表达和调控蛋白功能的作用。如在癌症治疗领域，非编码RNA（ncRNA）已被确定为关键基因表达调节剂。长非编码RNA（lncRNA）的表达揭示良性和转移性肿瘤中的多种基因表达谱。广谱的潜在靶点从一开始就赋予了RNA 治疗与其他治疗方案不同的天然优势。
随着对生命体各层次的认知加深，研发者们将逐渐征服更多的疾病，RNA 治疗或将为治疗、治愈各种疾病提供有效方案。
RNA 治疗机制不同于传统的化学合成小分子药物和大分子生物药，也不同于基于DNA 的基因治疗。RNA 治疗将重点放在数量更多、动态变化更丰富、可塑性更强的RNA 上，通过调控或改变传递信息（mRNA），达到影响结果（蛋白质）的目的。由于RNA 治疗的靶向性的选择面更广、理论效率更高和治疗方案的自由度更高，给予了大量研发空间尝试不同的靶向策略及给药方式。大量ASO 神经系统疾病药物研发结果也显示出RNA药物不寻常的药代动力学和药效学特性：包括复杂的活性摄取机制（ uptake mechanisms） ，低全身暴露（systemic exposure），较长的半衰期（half-lives）， 以及从亚细胞贮库（subcellular depots）的逐渐积累、释放[12]。
然而，RNA 治疗的发展并非一帆风顺。举个例子，ASO 互补mRNA 使得RNA 降解的RNA抑制机制早在20 世纪80 年代末90 年代初就被发现、阐述， 但第一款ASO 药物Fomivirsen在1998 年才被FDA 批准用于治疗巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）视网膜炎，其机制为与CMV 复制所必需的 immediate-early-2（IE-2）蛋白的mRNA 结合，从而抑制CMV 复制[13，14]。而后由于治疗方案的改变导致适应证人群骤减，在2002 年就退出市场。 真正意义上的被FDA 批准的、基于反义结合原理（antisense）抑制细胞内mRNA 表达的ASO 药物Mipomersen 更是到2015 才出现[15，16]。而RNA 剪切、外显子跳跃的原理也早在20 世纪90 年代末就被提出，多家公司如Sarepta，Lonis，Biogen 也早早起步，但经过多年的试错，才终于在2016 年出现了首款基于选择剪切原理的药物Eteplirsen 获FDA 批准上市；而概念还相对较新的mRNA 疗法则更是面临着半衰期短、mRNA 免疫原性风险、最大化蛋白质表达、mRNA 的递送等问题[17]。此外，RNA疗法很多的时候不能治愈疾病，但是价格极其高昂，例如引言中提到的Patisiran，每位病人每年花费就高达45 万美金[18]。另外，这些RNA 疗法常常伴随着一定风险的副作用，如ASO 药物常存在血液凝固异常和血小板减少以及肾脏损害等风险[19]。
种种现象，不禁让人们思考，如何评估RNA分子治疗的风险和获益？ RNA 治疗已经在稳定性提高、脱靶性降低、以及靶向药物活性增强等方面取得突破，这与新型寡核酸药物化学分子的发现、递送介质的优化、对于寡核酸药物作用机制的更好理解、以及对与疾病机制的更深入解析密切相关[12]。随着临床试验的开展，人们对于RNA 药物也逐渐形成了更加丰富的认识，发现了RNA 治疗方案有其他药物不可比拟的迭代速度、生产效率和药物学特性。
复杂和多变的背后，既代表着机会，也提示着风险。许多科学家相信，RNA 在生物学中的作用是无限的，因而它的治疗潜力也是无限的。人们不仅可以靶向mRNA，还可以靶向非编码RNA（ncRNA）。NcRNA包括microRNA（ miRNA），以及repetitive RNA，intronic RNA， 和长ncRNAs（lncRNA） ，它们都具有广泛的控制基因表达和调控蛋白功能的作用。如在癌症治疗领域，非编码RNA（ncRNA）已被确定为关键基因表达调节剂。长非编码RNA（lncRNA）的表达揭示良性和转移性肿瘤中的多种基因表达谱。广谱的潜在靶点从一开始就赋予了RNA 治疗与其他治疗方案不同的天然优势。
随着对生命体各层次的认知加深，研发者们将逐渐征服更多的疾病，RNA 治疗或将为治疗、治愈各种疾病提供有效方案。
作者简介
胡珑于，癌症生物学博士，蛋核科技（深圳）有限公司，创始人
周琦凌，癌症生物学博士，新加坡国立大学癌症科学研究所RNA 生物学中心，主要研究RNA 治疗
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来源：胡珑于，周琦凌.RNA 治疗，新药研发的另一种可能[J].中国食品药品监管.2018.11（178）：26-30.
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