原位杂交技术在检测HBV核酸和cccDNA中的应用
徐通, 张小楠, 袁正宏复旦大学附属上海市公共卫生临床中心HBV感染目前仍是一个严重的公共卫生问题，威胁着人...
徐通, 张小楠, 袁正宏
复旦大学附属上海市公共卫生临床中心
HBV感染目前仍是一个严重的公共卫生问题，威胁着人类的健康。据世界卫生组织报道，全球现有2.57亿慢性HBV感染者，每年约有88.7万人死于HBV感染所导致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌。HBV是正链不完整的部分双链DNA病毒，属嗜肝DNA病毒家族，家族中还包括鸭乙型肝炎病毒（DHBV）和土拨鼠肝炎病毒（WHV）等。HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）以超螺旋微小染色体形式存在于肝细胞核内，是启动病毒RNA转录和后续翻译、复制的关键模板,是维持HBV慢性感染状态的关键因素，且cccDNA结构高度稳定，难以清除。检测cccDNA对进一步认识HBV的致病机制及指导抗病毒药物使用有重要意义，但传统的检测手段存在灵敏度或特异度方面的不足，并且只能反映出样本中cccDNA的平均水平。原位杂交技术（ISH）在研究cccDNA的组织分布、丰度变化等方面有着重要意义，可为HBV的研究提供新信息，现就近年来ISH的发展以及在慢性乙型肝炎中的应用综述如下。
HBV基因组全长为3.2 kb，其成熟病毒颗粒以松弛环状DNA（rcDNA）的形式存在。当HBV感染宿主肝细胞时，在NTCP等受体的介导下进入肝细胞胞浆，rcDNA脱去结合于其负链的HBV聚合酶pol成为脱蛋白松弛环状DNA (PF-rcDNA),随后核衣壳解聚，并释放PF-rcDNA至细胞核中。胞核中的PF-rcDNA通过进一步修复，形成超螺旋的cccDNA。HBV以cccDNA 作为模板转录出病毒亚基因组RNA,于胞浆中翻译成病毒各蛋白，其中转录出的pgRNA不仅作为mRNA翻译产生病毒聚合酶pol及核心蛋白Core，还作为逆转录模板被包装于核心颗粒中，从而形成成熟的核心颗粒，随后被外膜蛋白包裹产生子代病毒粒子释放至胞外。此外，新生的成熟核心颗粒还可再次入核，扩充细胞的 cccDNA 储存库。已有的大量研究提示HBV cccDNA高度稳定是HBV持续感染的关键。
目前临床上用于治疗慢性乙型肝炎的药物主要有两类，即干扰素和核苷类似物。干扰素治疗中，约有30%~40%的患者产生HBV DNA阴转，HBeAg血清转换的病毒学应答，有不到10%的患者可发生HBsAg阴转，但其副作用较多，且不适用于失代偿期乙型肝炎患者。核苷类似物对HBV复制的抑制效果较好，但无法清除cccDNA，HBsAg清除率极低，停药后容易反弹，因此需长期服药。HBV cccDNA水平是指导临床慢性乙型肝炎抗病毒治疗的重要依据之一，cccDNA的清除也是抗病毒治疗期望达到的最佳终点之一。如何有效耗竭或清除肝脏中残余的cccDNA，是目前着眼于治愈乙型肝炎的药物、免疫治疗研究的重要目标。
2 HBV cccDNA检测的技术困难
对肝细胞内HBV cccDNA的监测被认为是评估抗病毒药物疗效以及临床治愈的金标准。但是，HBV cccDNA的定量检测存在一系列难点。首先，缺乏合适的研究模型，通过对DHBV的研究，已经对cccDNA的形成及维持有了大致的了解，但它不能反映慢性乙型肝炎患者体内真实的情况。其次，慢性感染者肝穿刺标本比较珍贵，且相对DHBV、WHV慢性感染标本，HBV cccDNA含量较低（0.1~1拷贝/细胞）。更重要的是，目前缺乏既灵敏准确又操作简便的检测技术。Southern blot是检测cccDNA的传统方法，虽然其受到广泛的承认，但此法灵敏度低，操作复杂，不适用于大量临床标本的检测；而后期开发的cccDNA特异性实时荧光定量PCR（qPCR）灵敏度高，操作便捷，但其特异性有待提高。此外，考虑到 cccDNA在患者肝组织内的分布是不均一的，传统的定量检测方法只能反映出其平均水平，无法显示其在空间上的定位信息，因此亟需开发特异度、灵敏度更高的，且反映cccDNA空间定位信息的检测方法。
3 ISH的发展及在病毒学研究中的应用
ISH是将特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或者组织切片中核酸进行杂交并对其进行检测的方法，能够在细胞和染色体水平上显示特异性核酸的分布及其意义。1969年，Pardue和Gall利用放射性同位素标记的RNA探针成功检测到非洲爪蟾细胞核内的rDNA，同年John等使用的放射性标记探针，利用放射自显影检测一些高度重复序列DNA在染色体上的定位，开创了ISH这一全新技术。不过，由于同位素标记探针存在放射性污染、稳定性差、操作耗时等缺点，科学家们逐渐开始研究非放射性标志物来替代同位素。1981年，Bauman等将RNA 探针的3′端用荧光素进行标记，并检测到了目的DNA。同年，Langer等首次采用了生物素标记核苷酸探针，并成功地进行了染色体原位杂交，建立了非放射性ISH。1987年, Boeringer Mannheim公司将地高辛标记的有关试剂投放市场。非放射性标记探针（生物素、地高辛等）使得ISH更加安全方便，且提高了分辨率，逐渐替代了放射性标记探针。
随着技术发展，ISH与其他技术结合，在病毒学研究方面发挥了重要作用。Haase等于1990年建立了一种将PCR技术和ISH相结合的原位多聚酶链式反应技术 (in situ PCR)，相比传统的ISH，该技术可将感染细胞中梅迪-维斯纳病毒DNA检测的灵敏度提高2个数量级。
在定量PCR技术出现之前，Chiron公司开发的支链DNA(branched DNA，bDNA)信号放大技术曾是病毒载量检测的主导技术。bDNA技术是一种不依赖分子扩增的核酸杂交信号放大检测技术。当探针特异捕获目标核酸后，可结合多个酶标志物的bDNA与探针结合，进而通过分支上酶标志物的发光获得放大的靶标信号，从而大大提高了原位杂交的灵敏度，同时也可保证检测的高特异度。bDNA可实现HIV-1 RNA、HBV DNA、HCV RNA等病毒核酸的高灵敏度定量。在组织切片水平，bDNA技术也显示了良好的信号放大能力，例如针对人乳头瘤病毒设计的探针可检测到病毒的mRNA与DNA，并在混合细胞中成功区分人乳头瘤病毒的不同亚型。由Panomics研发推广的ViewRNA系列试剂盒就是基于bDNA放大机制的单细胞单拷贝级别灵敏度的ISH。其主要特点是采用了特异性的双Z探针，避免了传统长链RNA探针的弊端，提高了特异度，配以级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标RNA。
4 ISH应用于HBV核酸检测的进展
ISH对阐明肝内病毒的传播和分布, 病毒的复制机理, 致癌和致病机理等研究起着十分重要的作用。因此，利用高灵敏度的ISH检测肝组织切片上病毒核酸的信号及空间分布显得非常必要。
4.1 ISH检测HBV DNA、RNA
1981年，Gowans等应用放射性同位素标记探针，检测HBV感染肝细胞内的HBV DNA，首次将ISH引入HBV的研究。利用ISH检测HBV DNA可以观察到其在肝组织内分布特点，ISH还可以与免疫组化相结合，在同一份组织样本上同时显示出胞内核酸与抗原的定位信息，从而反映不同病程中肝内HBV DNA分布的变化情况，帮助进一步认识HBV生活周期。
为了进一步提高ISH检测组织中HBV DNA灵敏度，特别是组织中低拷贝的核酸，Nuriya等通过设计特异性探针，调节蛋白酶的种类、浓度和处理时间，控制PCR循环数等方式优化实验条件，提高了原位PCR特异度，成功在感染组织中定位出DNA与RNA，并通过多次实验证明该方法的重复性较好。原位PCR有着更高的灵敏度，但是特异度仍然是个挑战。
相比原位PCR,基于bDNA的信号放大技术在检测HBV DNA及RNA时更有一系列优势：（1）无需经受温度循环，更好保存样本原始形态；（2）不用考虑组织中存在酶抑制剂而影响PCR扩增效率的情况；（3）避免了交叉污染或者扩增产物向临近细胞扩散。这些技术为临床医生提供了直接定量定位HBV DNA及RNA的能力，在HBV基本病毒学的研究和临床应用中非常适用。
4.2 ISH检测HBV cccDNA
在1998年，Yeh等首次报道了将ISH用于cccDNA检测，研究者在整合有HBV基因组的HepG2细胞中，用地高辛标记的RNA探针检测到了cccDNA，但该体系未在肝组织中验证。Zhong等还尝试了将结合滚环扩增（RCA）与原位PCR相结合，在RCA处理之后采用5′端标记地高辛的cccDNA特异探针进行原位PCR，最终可以实现单个细胞内检测到2个拷贝cccDNA的灵敏度，可反映出cccDNA水平与肝组织病理学特征的关联，从而评价抗病毒治疗效果。但该方案中还有些不足，比如原位PCR可能导致扩增的DNA产物扩散到邻近细胞，以及交联的组蛋白或其他cccDNA结合蛋白可能阻碍PCR的有效扩增。
2016年，本课题组改进了ViewRNA技术，在bDNA信号扩增技术基础上二次开发，成功建立了一种能在组织水平显示cccDNA分布的ISH。该方案设计了3组探针分别针对HBV DNA正链、负链以及rcDNA正链的缺口处，经过相应的酶处理，可以特异地检测到HBV DNA（正链或负链）、HBV RNA（pgRNA或总HBV RNA）以及cccDNA。同时该方法可以与HBV主要抗原的免疫组化或免疫荧光结合，获得了病毒核酸与抗原的综合图像，并由此提出了在单细胞水平HBV存在“抗原富集期”“DNA富集期”和“潜伏期”的三阶段假说，为进一步针对患者不同病情设计清除HBV cccDNA提供理论基础。当然，该方法也存在一些局限性，比如在HBV的生活周期中可能发生HBV DNA整合到基因组的情况，而该方案中的cccDNA检测探针无法区分cccDNA与整合DNA。
4.3 荧光ISH检测HBV cccDNA
上述ISH通常使用化学显色法，虽然此法在临床应用较广，但其空间分辨率具有一定限制，无法揭示核酸在亚细胞结构中的精细定位。而荧光标记探针通过宽场显微镜成像的理论分辨率可达200 nm左右，因此荧光ISH可获得病毒在细胞内高分辨率图像。Li等建立了以生物素标记探针、荧光标记亲和素为基础的FISH检测体系，分别在模拟有无抗病毒治疗的情况下，观测DHBV cccDNA与HBV核内DNA在细胞分裂时的命运。该研究有助于加深对HBV生活周期的理解，有助于未来进一步确认cccDNA在核内储藏区域的研究。此外，本课题组也在前期工作基础上，在bDNA放大体系的最后一步改为荧光标记的Label probe，建立了一套荧光ISH，在HBV复制系统HepAD38及感染系统HepG2-NTCP中，使用3D-STORM 和3D-SIM成像系统,获得了HBV RNA和DNA的图像，提高了空间分辨率，有助于进一步剖析HBV在宿主细胞内传播过程中的关键分子事件，并验证cccDNA维持和转录的关键表观调控因子。由于细胞培养系统中存在正链相对完整的rcDNA，因此无法完全确保针对正链缺口区域的探针对cccDNA的特异性。尽管如此，凭借FISH的高分辨率，可利用cccDNA染色质化的特点，通过与组蛋白的共同染色，确定核内HBV DNA的分子性质。HBV荧光ISH的建立将帮助研究者深入探讨病毒感染、扩增周期中关键事件（cccDNA转录，pgRNA翻译与核衣壳包装、病毒成熟释放等）的分子机制，为鉴定病毒复制关键宿主因子、开发新一代抗病毒药物提供线索。
5 挑战与展望
ISH相比其他传统的HBV核酸和cccDNA检测技术，主要优势在于能够显示各类型核酸在组织上的位置分布和丰度变化，为HBV发病机制研究提供组织学信息。HBV DNA与cccDNA的ISH有望与病毒抗原的免疫组化相结合，纳入到慢性乙型肝炎临床病理常规检查。当然，要达到临床应用，相关技术在检测灵敏度以及特异度方面仍需进一步提高。
在乙型肝炎相关临床、基础研究方面，ISH拥有多项独特的优势。首先，ISH可与其他检测方法，如免疫组化与特殊染色联用，以获取病毒复制与慢性乙型肝炎组织学进展的相互关系，未来也有望和其他新技术（如单细胞质谱技术、单细胞表达谱技术等）联合运用，加深对病毒致病机制的理解。其次，在乙型肝炎相关细胞、动物模型中，如将荧光ISH与超分辨率显微成像技术相结合，可获得HBV复制过程中一些关键过程的纳米尺度图像，为病毒与宿主相互作用以及药物靶标的深度研究提供了强有力的技术基础。
总之，HBV核酸和cccDNA的原位检测对于临床评价慢性乙型肝炎疾病状态，指导抗病毒药物运用以及深入研究HBV生活周期等方面，有着非常重要的意义。ISH的进一步优化无疑将加速上述研究的进展。
引证本文：XU T, ZHANG XN, YUAN ZH. Application of in situ hybridization in the detection of hepatitis B virus nucleic acids and cccDNA[J]. J Clin Hepatol, 2019, 35(6): 1197-1200. (in Chinese)
徐通, 张小楠, 袁正宏. 原位杂交技术在检测HBV核酸和cccDNA中的应用[J]. 临床肝胆病杂志, 2019, 35(6): 1197-1200.
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本文编辑：王亚南
微信编辑：邢翔宇
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