循环肿瘤细胞（CTC）研究需要注意的问题

循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells，CTC)是指从原发肿瘤或转移灶脱落、发生上皮-...



循环肿瘤细胞 (circulatingtumor cells，CTC)是指从原发肿瘤或转移灶脱落、发生上皮-间质转化进入患者外周血血液循环的恶性肿瘤细胞，CTC在肿瘤研究和临床诊断上的作用逐渐得到认可，外周血中CTC存在与否以及数量多少不但可以用于肿瘤的早期诊断，还可以用于评估肿瘤预后、监测肿瘤的转移和复发。FDA相继在2004年、2007年和2008年批准外周血CTCs检测的CellSearch系统用于转移性乳腺癌，结直肠癌和前列腺癌的预后评估、PFS和OS的预测。

随着研究的深入，CTC逐渐成为重要的肿瘤样本来源，为临床提供参考和指导。目前，对CTC的研究正逐步从单纯的计数分析进展为对捕获到的CTCs进行更深层次的分子特征分析，一些前沿的研究将CTC分离出来进行单细胞全外显子测序或转录组测序分析，最大程度的获得这些细胞的遗传信息，进行深入挖掘，这将对循环肿瘤细胞的研究产生积极的影响。

然而CTC数量较为稀少，多数病人每10ml外周血中仅有1–10个CTC，因此充分发掘CTC的研究和临床价值并非易事。需要通过专门技术，才能将CTC与病人体内良性的其他循环细胞（如红细胞、白细胞）以及上皮细胞分离开来，开展研究。成功分离CTC需要注意以下的关键因素。

（1）样本采集：

样本采集是分离CTC关键性的第一步。所采集血液的体积必须接近推荐量，以确保其中抗凝血剂和稳定剂的适当比例。血样的储存和运输必须在推荐温度范围内进行，即4°C至10°C冷藏、或室温环境15°C至30°C。血液不可冷冻，处理步骤应在抽血后的指定时间内完成——时间依采集管类型和CTC富集方法不同而异，可能为数小时或数天。如果超过指定时间，即便在存在抗凝剂的条件下，一些血液样本也可能出现凝血或结块。此类样本得到的检测结果便可能不准确。有些富集技术需进行额外步骤，要求实验人员格外谨慎。

（2）选择合适的富集方法：

CTC富集方法众多，但通常可归为两大类：通过物理特性或生物特性进行分离。实际操作中，多数富集方法会将这两种原理相结合。通过大小、密度、带电性和结构性这些物理性质将CTC与血液中的其他细胞分开。白细胞比CTC小，所以可使用8 μm孔径的滤膜去除白细胞。可使用Ficoll（聚蔗糖）或其他类似的密度梯度介质将CTC与红细胞及血浆中的单核细胞分开。因CTC相对于血液中其他细胞的体积和抗变形能力较高，可使用微芯片捕获CTC。之后通过介电电泳（DEP）依CTC的电荷性质将其分离出来。

CTC的生物分离包括正选择和负选择两类，可以通过免疫方法或微流体方法实现。抗体正选择法使用的是EpCAM等抗上皮标记物、N-钙粘蛋白等抗间质标记物、或plastin 3等抗上皮细胞和间充质标记物。负选择法则使用抗CD45的抗体来去除白细胞。无论采用何种方法，富集此类数量较少的细胞时都须严格遵循操作方案。

根据研究目的选择合适的分离平台，确保获得尽可能多、且纯度符合要求的肿瘤细胞，是顺利开展下游研究的保障。

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