《科学》：CRISPR终于法力无边了！麻省科学家创造出几乎无限制的CRISPR/Cas系统，基因编辑想改哪里改哪里丨科学大发现
终极形态，近了！...
朋友们~本周CRISPR/cas技术再次迎来重大，突破！
我们知道，CRISPR/cas技术虽然已在短短几年内成为目前最好用，的基因编辑工具之一，但是实际上它的应用还要，受到特定基因序列的限制，这就意味着它并不能够随我们所欲地编辑所有的基因片段。
而一项最新的研究则完全，放开了crispr/Cas的束缚，现在“基因魔剪”可以说是真的“想剪哪里剪哪里啦”！
这项新研究提出了，两种人工改造的cas酶，SpG和SpRY，其中SpRY几乎可以不受限制地对全部序列具有编辑活性。这意味着我们能够对以前根本无法涉及的致病突变进行修改，基因编辑能为人类做的贡献，大大增加了[1]！这项研究发表在《科学》杂志上，通讯作者是来自麻省总医院，的benjamin P. Kleinstiver。
图源 | pixabay
我们都知道，CRISPR/cas系统原本是原核生物的一种，自我保卫机制，CRISPR/cas的存在能够让原核，生物避免外源遗传物质的入侵。除了作为识别重点，的crispr序列，其实还有另外一个，重要的序列，原间隔序列临近基序（PAM）。简单来说，没有对应的PAM，就启动不了CRISPR/Cas系统。
pam根据cas酶的，种类不同而有所不同，目前使用最广泛的、来自化脓链球菌的，spcas9，主要识别的是NGG序列。
很显然，仅能识别ngg是不足以满足对所有序列，编辑的需求的。
对蛋白来说，结构决定功能。SpCas9识别NGG，主要是通过r1333和r1335两个位置氨基酸侧链，和鸟嘌呤的结合[2]，那么我们是不是可以通过替换氨基酸，来让spcas9识别其他的pam序列呢？
关键在R1333和R1335
其实已经有很多科学家尝试过利用分子进化的方法，改变pam作用域中的氨基酸来改变，cas酶的pam偏好。比如我们之前也介绍过的刘如谦的xCas9，就是通过噬菌体辅助持续，进化器（PACE）来制造大批量的突变，从中筛选出pam适应更广，的cas酶。
顺便一提，xcas9的战绩是，适用性扩大了4倍。
而今天介绍的研究，则是采用了另一种思路，结构导向工程（structure-guided engineering），精确地对个别，氨基酸序列进行替换，以获得想要的蛋白性状。
为了一步步扩大spcas9的pam，适用范围，研究者们决定先搞出，一个能够识别ngn的1.0版本来。
科研经验告诉学者们，识别pam的关键就在于，某个或某几个氨基酸残基[3]。通过比对SpCas9-VQR、SpCas9-vrqr等前人开发的变体，和它们识别的pam序列，研究者们很快提出了，几个可能的氨基酸取代方案。为了测试这些变体的活性，研究者们还开发了一种高通量测试PAM活性的方法（HT-PAMDA）来分析变体对，pam的偏好。
最终，在各种氨基酸取代，组合方案里，研究者们获得了一种能够基本，等效识别nga、NGC、 NGG、NGT的变体，它具有五个氨基酸取代（D1135L/S1136W/G1218K/E1219Q/R1335Q/T1337R），被命名为SpG。
通过在人类细胞中进行，的编辑测试，我们可以看到，spg对ngn可，实现基本等效识别，且效率要比spcas9以及其他，的变体更高。进一步实验显示，spg对ngg的编辑活性，达到51.2%，其他三类则达到了53.7%。
此外，spg也适用于单碱基(单，碱基)编辑器（BE）。
SpG可识别NGN，且活性更高
好，接下来继续扩大pam，范围。搞定了NGN，现在把NAN也加上，试试NRN（R即A+G）。
这一次，研究者们瞄准的是r1333位可能与腺，嘌呤产生的化学反应。HT-pamda测试出来的结果，显示，把r1333位置，替换成丙氨酸、半胱氨酸或脯氨酸就可以，有效识别nrn了。
经过一系列细化和筛选，最终研究者们得到的是，在spg（L1111R/A1322R）基础上，增加R1333P、A61R、N1317R的2.0版，SpRY。
为什么叫SpRY呢？
虽然在NGN上，SpRY活性不如SpG，不过spry同样能够有效，识别nan，NRN成立。比较惊喜的是，spry同样能够识别，nyn（Y即C+T）。在实验中，全部31个NYN位点，spry编辑效率高于，20%的有13个（42%），当然，普通的spcas9是一个也，做不到的。
鉴于对nrn的识别活，性比nyn更高，大约是一倍，spry就叫做，spry了。
与SpG同样，spry也适用于单碱基(单，碱基)编辑。
SpRY可识别几乎全部PAM
不言而喻，spg和spry大大扩大，了crispr/Cas系统的极限，几乎整个基因组都“触手可及”了！另外，根据实验数据，spg和spry的脱靶，效应与spcas9水平接近，新增的脱靶问题主要，来源于扩展大的pam范围，而另外一种HF1变体则能够消除这类脱靶并提升编辑效率。
说不定我们还可以期待，一下3.0版本呢！
编辑神叨叨
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参考资料：
[1]https://science.sciencemag.org/content/early/2020/03/25/science.aba8853
[2]. C. Anders, O. Niewoehner, A. Duerst, M. Jinek, Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature 513, 569–573 (2014). doi:10.1038/nature13579 Medline
[3]B. P. Kleinstiver, M. S. Prew, S. Q. Tsai, V. V. Topkar, N. T. Nguyen, Z. Zheng, A. P. W. Gonzales, Z. Li, R. T. Peterson, J.-R. J. Yeh, M. J. Aryee, J. K. Joung, Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature 523, 481–485 (2015). doi:10.1038/nature14592 Medline
本文作者 | 代丝雨
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