『珍藏版』Nat Biotech综述 CRISPR-Cas实验的设计与分析工具

 

作者希望此文能为CRISPR-cas系统的应用者在选择评估相关软件工具,时提供合理的指导。...



撰文 | 木兰之枻

责编 | 兮

自2012年CRISPR-Cas系统的基本原理被厘清之后,其在基因组操作中的,应用有了飞速的发展。总体而言,CRISPR-Cas系统的应用可分为三大类:一是以改变特定,碱基为目标的“编辑”研究;二是插入缺失(indels)为目标的“敲除”实验;最后一类则是通过基因组定位以招募其它蛋白实现基因,表达调控或表观遗传修饰的“募集”实验。无论哪类研究,均依赖于向导RNA(sgRNA)引导Cas核酸酶(sgRNA-Cas复合物)实现基因组的靶向定位。现如今,CRISPR-cas系统多样化程度的日益增加让基因组操作,研究更加快速和灵活,众多的软件和分析工具也因此而诞生以用于,相关实验的设计与分析,这包括sgrna的设计优化工具以及实验,数据的分析工具。这其中大规模crispr遗传筛选的数据,分析软件的研发更是当下的重点。

2020年4月13日,来自美国哈佛大学与麻省理工学院Broad研究所的John G. Doench等在Nature Biotechnology发表题为Design and analysis of CRISPR–Cas experiments的综述。文章根据CRISPR-Cas实验的不同,将软件工具分为1sgrna的,设计与选择,2crispr编辑和敲除实验的结果分析以及3,混合遗传筛选数据的大规模分析三大类并加以总结,作者希望此文能为CRISPR-cas系统的应用者在选择评估相关软件工具,时提供合理的指导。

sgRNA的设计与选择工具


靶位点的普遍性

sgRNA是CRISPR-cas系统识别基因组,中靶位点的关键,其序列与靶位点互补。靶位点的选择则受限于特定,的pam序列,其序列特征因Cas核酸酶而异。因此,特定cas核酸酶靶位点在基因组,中的普遍性取决于pam序列的分布情况。为拓宽Cas核酸酶的适用范围,研究者尝试对其加以改造以,改变其对应的pam序列。就应用上而言,CRISPR-cas系统可用来修复致病,的snp突变,其原理是利用sgRNA-Cas复合物在SNP位点附近(5bp之内)引入DNA双链断裂(DSBs),而后借助于修复模板通过同源重组对,致病snp加以修复。从理论上讲,clinvar数据库中所有的致病snp,位点均可通过至少一种cas核酸酶加以修复,且sgRNA/SNP位点的数量接近30个,这表明CRISPR-cas系统介导的同源重组修复,在致病snp修复中有广泛的适用性。

为改善CRISPR-cas系统基因组操作的准确性,和效率,研究者开发出单碱基(单,碱基)编辑系统胞嘧啶碱基编辑器(CBEs)和腺嘌呤碱基编辑器(ABEs),可在不引入dsbs的情况下诱导特定,位点碱基的精准改变。从理论上而言,cbes和abes可修复clinvar,数据库中80%以上的致病SNP,然而与上文提到的,同源重组修复相比,单碱基(单碱基)编辑的活性,窗口更加局限,对应的sgRNA/SNP位点数量也只有2.3个。不过最近prime编辑器的出现让研究者,看到了更多可能:该编辑器理论上可在,基因组的任意位点引入插入、缺失或碱基替换,但其效果还有待深入研究。

与单碱基编辑系统相比,敲除实验在sgrna位点的选择,上更加灵活:基因的多数外显子区域,均可作为靶点完成功能敲除。此外,CRISPR为基础的基因激活(CRISPRa)和抑制(CRISPRi)策略的sgrna位点,的选择窗口一般


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