黄曲霉毒素试样

吃货的烦心事儿~~

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作为吃货，家里必定要囤满瓜子、薯片、鸭脖、蛋糕、可乐……

但是，你知道吗？花生瓜子放久了，就会有一股哈喇味，发霉，这就会产生黄曲霉毒素，这可是强致癌物呀！看看SICEX是如何检测的吧！

一、背景

黄曲霉毒素（Aflatoxins）是生长在食物及饲料中的黄曲霉和寄生曲霉代谢的一组化学结构类似的产物，特曲霉也能产生黄曲霉毒素，但产量较少，目前已分离鉴定出的黄曲霉毒素有17种，主要是黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2以及由B1和B2在体内经过羟化而衍生成的代谢产物M1、M2等。黄曲霉毒素的基本结构为二呋喃环和香豆素，B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素），前者为基本毒性结构，后者与致癌性有关。B1的毒性（其毒性比氰化钾毒性高）及致癌性极强且耐热（B1的分解温度为268℃左右，一般烹调加工破坏很少），在天然污染的食品中以B1最为多见。

黄曲霉毒素是一种毒性极强的物质。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。由于黄曲霉毒素危害性大，存在范围广，为了预防黄曲霉毒素中毒事件的发生，维护人类健康，世界上已有70多个国家和地区对食品中黄曲霉毒素的含量作了限量要求。我国食品中黄曲霉毒素B1允许量标准（GB2761-2011）规定，玉米、花生仁、花生油中不得超过20 μg/kg，大米、其他食用油中不得超过10 μg/kg，其他粮食、豆类、发酵食品中不得超过5 μg/kg，婴儿代乳食品中不得超过0.5 μg/kg，其他食品可参照以上标准执行，其中婴幼儿配方食品及婴幼儿辅助食品按GB5009.24方法测定，其它食品按GB/T18979执行；标准中同样规定牛乳及其制品中黄曲霉毒素M1限量不得超过0.5 μg/kg，其中婴幼儿配方食品按GB5009.24规定方法测定，乳及乳制品按GB5413.37方法测定。

目前，测定食品中的黄曲霉毒素的方法有薄层层析法、液相色谱法、放射免疫分析法、酶联免疫法、免疫层析法、微柱筛选法、金标试纸法等。我国现行使用的国家标准GB/T 5009.24-2011中规定了食品中黄曲霉毒素B1、M1的薄层层析测定方法。本文中将详细介绍采用AB SCIEX API 5500 LC-MS/MS检测黄曲霉毒素M1、M2、G1、G2、B1、B2六种，并且经实验证实SCIEX 4000系列（包括API4000、API4000+、4000QTRAP®）、API5000以及5500QTRAP®同样适用与该方法。

二、化合物信息

表1. 化合物基本信息

三、前处理方法

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3.1 黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2提取（GB 18979-2003）

3.1.1提取

3.1.1.1 大米、玉米、小麦、花生及其制品：准确称取经过磨细（粒度小于2 mm）的试样25.0 g于250 mL具塞锥形瓶中，加入5.0 g氯化钠及甲醇一水（7+3）至125.0 mL（V1），以均质器高速搅拌提取2min。定量滤纸过滤，准确移取15.0 mL（V2）滤液并加入30.0 mL（V3）水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1-2次，至滤液澄清，备用。

3.1.1.2 植物油脂：准确称取试样25.0 g 于250m L具塞锥形瓶中，加入5.0 g 氯化钠及加入甲醇-水（7+3）至125.0m L（V1），以均质器高速搅拌提取2min。定量滤纸过滤，准确移取15.0mL（V2）滤液并加入30.0 mL（V3）水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1-2次，至滤液澄清，备用。

3.1.1.3 酱油：准确称取试样50.0g于250.0mL具塞锥形瓶中，加入2.5 g氯化钠及加入甲醇-水（8+2）至100.0 mL（V1），以均质器高速搅拌提取1 mine定量滤纸过滤，准确移取10.0 mL（V2）滤液并加入40.0 mL（V3）水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1-2次，至滤液澄清，备用。

3.1.1.4 食醋：准确称取5.0g样品，加入1.0g氯化钠，以pH7.0磷酸盐缓冲溶液稀释至25.0mL（V1），混匀，定量滤纸过滤。取10.0mL（V2）滤液加入10.0mL（V3）缓冲液，混匀，以玻璃纤维滤纸过滤1-2次，至滤液澄清，备用。

3.1.2 黄曲霉毒素M1提取（GB 5413.37-2010）

3.1.2.1 乳：称取50 g（精确至0.01 g）混匀的试样，置于50 mL具塞离心管中，在水浴中加热到35℃～37 ℃。在6000 转/分钟下离心15 min。收集全部上清液，供净化用。

3.1.2.2 发酵乳（包括固体状、半固体状和带果肉型）：称取50g（精确至0.01g）混匀的试样，用0.5 mol/L 的氢氧化钠溶液在酸度计指示下调pH至7.4，在 9500 转/分钟下匀浆5 min，以下按3.1.1.1进行操作。

3.1.2.3 乳粉和粉状婴幼儿配方食品：称取 10 g（精确至0.01 g）试样，置于250 mL 烧杯中。将50 mL 已预热到50 ℃的水加入到乳粉中，用玻璃棒将其混合均匀。如果乳粉仍未完全溶解，将烧杯置于50℃的水浴中放置30 min。溶解后冷却至20 ℃，移入100 mL容量瓶中，用少量的水分次洗涤烧杯，洗涤液一并移入容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀后分别移至两个50 mL离心管中，在6000转/分钟下离心15 min，混合上清液，用移液管移取50mL上清液供净化处理用。

3.1.2.4 干酪：称取经切细、过10目圆孔筛混匀的试样5g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，加2 mL水和30 mL甲醇，在9500 转/分钟下匀浆5 min，超声提取30 min，在6000 转/分钟下离心15 min。收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。在分液漏斗中加入30 mL石油醚，振摇2 min，待分层后，将下层移于50 mL烧杯中，弃去石油醚层。重复用石油醚提取2次。将下层溶液移到100 mL圆底烧瓶中，减压浓缩至约2 mL，浓缩液倒入离心管中，烧瓶用乙腈-水溶液（1+4） 5 mL分2次洗涤，洗涤液一并倒入50 mL离心管中，加水稀释至约50 mL，在6000 转/分钟下离心5 min，上清液供净化处理。

3.1.2.5 奶油：称取5g（精确至0.01 g）试样，置于50 mL烧杯中，用20 mL石油醚将其溶解并移于250mL具塞锥形瓶中。加20 mL水和30 mL甲醇，振荡30 min后，将全部液体移于分液漏斗中，待分层后，将下层溶液全部移到100 mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪中减压浓缩至约5 mL，加水稀释至约50mL，供净化处理。

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3.2 净化

3.2.1 黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2净化（GB 18979-2003）

3.2.1.1 大米、玉米、小麦、花生及其制品、植物油脂：将免疫亲和柱连接于20. 0 mL玻璃注射器下。准确移取15.0mL（V4）样品提取液注人玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6 mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2mL-3 mL空气通过柱体。以10 mL水淋洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2 mL-3mL空气通过柱体。准确加入1.0mL（V）色谱级甲醇洗脱，流速为1 mL/min-2 mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

3.2.1.2 酱油：将免疫亲和柱连接于10.0 m L玻璃注射器下。准确移取10.0 mL（V4）酱油样品提取液注人玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6 mL-/min流速缓慢通过免疫亲和柱。用10 mL 0. 1肠的吐温-20/PBS清洗，再以10 m1_水清洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2 mL-3 mL空气通过柱体。准确加入1.0 mL[/b]>>>

4.1 液相条件

色谱柱：Waters UPLC HSS T3, 2.1X100mm, 1.8μm；

柱温：25℃，流速：300μl/min；

流动相：A：水（含0.1%甲酸），B：50/50乙腈/甲醇；

梯度洗脱，洗脱条件见表2.

表2. 液相色谱条件

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4.2 质谱条件

离子源：Turbo V™ 离子源；

扫描模式：正离子；

采集模式：多反应监测MRM；

表3. 氯霉素类化合物MRM离子对

五、定量质谱数据

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5.1 化合物保留时间

利用色谱柱梯度洗脱，得到分离效果良好的色谱图（见图1），此时六种黄曲霉毒素浓度为5 μg/mL。

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5.2 灵敏度检测数据（基质加标ppb）

通过添加基质测试方法的灵敏度，图2中为浓度为0.05 μg/mL，定量离子见表4，此时S/N基本为10（按照噪音的3倍标准偏差计算），所以定义该方法除M2最低检测限（LOQ）为0.1 μg/mL 外，其它化合物LOQ为0.05 μg/mL。

图1. 黄曲霉毒素的色谱图

图2. 黄曲霉毒素LOQ的色谱图表4. 黄曲霉毒素对应保留时间

六、重现性数据

以黄曲霉毒素B1、B2、M2为例，列举黄曲霉毒素质谱检测方法的重复性实验数据。在实验结果中可以看到即使信号强度相对较弱的黄曲霉毒素M2在浓度为0.05 μg/mL的时候，结果重现性均小于或等于6%，说明该方法对于黄曲霉毒素的检验结果具有间出现低，检出限低，重复性好的优点。

基质加标得到浓度为0.05ppb的样品重复进样11次，得到该浓度下黄曲霉毒素B1的标准偏差（%CV）为6%，满足方法中“在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%”要求。