【徕卡学院】小身材,大能耐——论“物镜校正环调节”对显微成像的影响

 

盖玻片是显微镜制样中常用的耗材,但是盖玻片是有厚度的,它会对光线穿行造成一定的改变,从而影响成像的清晰度和亮...



盖玻片是显微镜制样中常用的耗材,但是盖玻片是有厚度的,它会对光线穿行造成一定的改变,从而影响成像的清晰度和亮度。由于绝大部分的物镜是针对0.17mm(或者称为#1.5)盖玻片进行设计生产的,因此常规制样过程中,显微镜厂商一般推荐使用厚度为0.17mm的盖玻片以达到最佳的成像效果。

但是市面上的盖玻片耗材多种多样,厚薄不一(见表1)。除此之外,在倒置显微镜上,经常会使用诸如培养皿、多孔板等各种不同类型的耗材,有些器皿的底部厚度甚至达到了1-2mm。此时,必须使用带有校正环功能的物镜来进行成像。

表1、MatTek公司不同号码盖玻片及其对应的实际厚度

在倒置显微镜中,经常需要配置长工作距离物镜,因为长工作距离物镜不仅能用于载玻片观察,还能兼容不同底部厚度的器皿,进行活细胞观察。在长工作距离物镜上,我们经常会发现有一圈能左右转动的校正环(图1)。针对不同厚度的耗材,我们需要将校正环调节到不同位置。
图1、带校正环的20倍和63倍物镜。英文简写CORR代表此物镜带有校环,校正环可以左右转动,将环上的小点位置调节至当前使用盖玻片或器皿底部的厚度处。

别小看了这个校正环,它对显微成像会产生很大的影响。我们使用0.17mm盖玻片的样品进行了相应测试。明场成像时,如果校正环调节位置不对,成像清晰度会严重下降,而且是无法通过镜体调焦旋钮来改善的(图2)。在对荧光成像时,校正环设置不准确,除了清晰度下降以外,荧光的亮度也会发生大幅下降(图3)。因此,大家在倒置显微镜上观察时,记得要确认一下物镜是否带有校正环,校正环的位置调节是否正确。



图2、肾脏病理切片的明场成像。成像物镜为带校正环的40倍物镜,校正环位置分别为0(左上),0.17(右上),1.0(左下),2.0mm(右下)。
图3、Mito-TrackerRed标记的线粒体荧光成像。成像物镜为带校正环的63倍物镜,校正环位置分别为0.3(上),0. 7(中),0.17 mm(下)。

但是,倒置显微镜在物镜转盘处的操作空间狭小,对于手指粗壮的男同胞来说,伸手进去调节校正环稍显麻烦。特别是在搭载了双荧光光路和孵育箱的活细胞工作站上(图4),手动调节校正环会变得更加吃力。


图4、搭载双荧光光路的DMi8活细胞工作站(上图配置的为培养小室,下图配置的为大型孵育箱)

一直以来,徕卡将人性化设计贯穿于所有产品之中。针对倒置显微镜物镜转盘处操作空间狭小,手动调节校正环困难的问题,徕卡推出了独家设计的motCORR物镜,可通过外部旋钮和LAS X成像软件,即可对物镜校正环进行全电动调节(图5)。
图5、徕卡motCORR物镜(左),可通过外部旋钮(右下)和LAS X成像软件(右上)进行物镜校正环全电动调节。

尤其是在一些高端成像方式中,经常需要对物镜的校正环进行调节(图6)。motCORR能提供比手动调节更可靠的参数设置,而且更具有可重复性。
图6、徕卡motCORR物镜非常适用的三大应用方向:FCS(左)、多光子(中)和活细胞(右)成像。

如在FCS(Fluorescence Correlation Spectroscopy,荧光相关光谱)成像时,通过motCORR可轻松将共聚焦激发体积调节接近至数学模型,从而得出更加准确的FCS分析结果。其次,在做活体厚组织红外多光子成像时,由于组织内部的折射率不均一,会导致结构扭曲,荧光亮度大幅下降,通过motCORR对样品折射率的校正,以获得亮度和对比度更高的组织深部荧光图像,达到更大的穿透深度。此外,motCORR可与高数值孔径的水镜、水镜自动加水微泵和AFC(adaptivefocus control)自适应稳焦系统全面兼容,轻松实现完美活细胞成像。若需引用或转载,请联系我们,注明源自徕卡显微系统,并保留徕卡显微系统及原作者相关版权信息。


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