外泌体提取新方法

外泌体如何高效又经济的提取一直是广大科研工作者心上的一根刺，今天这篇文章的作者也许能解开这一难题呢...



本周三跟大家分享的文献来自《scientific reports》，IF=5.578，文章标题是ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of ExtracellularVesicles（ExtraPEG:用聚乙二醇法浓缩胞外囊泡）。

外泌体是一类由细胞分泌的病毒大小的膜状囊泡，它们携带有蛋白质与核酸，调节着胞内的沟通。目前较常用的外泌体提取方法是differential centrifugation (DC)——差速离心法。也有用试剂盒提取外泌体，但效率均不高。聚乙二醇（PEG）用于浓缩和纯化病毒已经超过50年，因为外泌体与病毒有着较为相似的生物物理特性，因此作者考虑用聚乙二醇来纯化外泌体，并且给出了新的浓缩提纯外泌体的方法。

首先，得确定加入的聚乙二醇的最适浓度是多少，因此作者分别选取5%-12%这8个浓度来探究哪个浓度更适合用于提取外泌体。

Figure1.聚乙二醇浓缩含有外泌体蛋白的囊泡。







(a)运用纳米粒子跟踪分析在所有PEG处理的微粒中进行分析。发现最佳的PEG浓度是12%。(b)不同浓度处理后的获得的微粒大小并没有统计上的差异。(c)检测到蛋白的最佳浓度是6-8%。(d,e)对外泌体蛋白溶解产物进行分析。(f,g)比较溶解产物的蛋白与(h)胎牛血清。

Figure 2.PEG法与标准外泌体提取方法的比较。







(a)每一种浓缩方法均优于差速离心法。(b)每一种方法得到的微粒大小均与报道的外泌体大小相符。(c) 8% PEG + wash组得到的微粒纯度与DC法相似，但高于商品化的方法。(d) 8% PEG + wash组和12% PEG + wash组的WB结果最显著。(e) 8% PEG + wash方法和DC法要明显优于商品化方法。(f,g)每一种方法都无法排除血清蛋白的干扰，但8% PEG + wash方法受到的干扰是最小的。

Figure 3.PEG能够浓缩高纯度的胞外囊泡。







(a)WB常被用于分析无血清培养基的样品纯度。PEG处理后的样品有大量外泌体标记物。(b)考马斯亮蓝染色用于分析蔗糖密度梯度离心法与PEG法分离的蛋白量的比较。(c) 8% PEG + wash方法获得了更高纯度的外泌体。(d)几种方法获得的外泌体大小上无差别。(e)电镜证实该囊泡为外泌体。

作者将他们的方法命名为ExtraPEG (Extracellular vesicle PEG-based precipitationprotocol).聚乙二醇为基础的胞外囊泡沉淀法。

Figure 4. ExtraPEG法胞外囊泡蛋白鉴定。

对从hela细胞用ExtaPEG法获得的蛋白进行质谱分析，鉴定了519种蛋白。其中97%(499 of 517)被证实为人类胞外囊泡蛋白。此外，95%(492 of 517)早先认为是外泌体来源蛋白。

Table 1.用ExtraPEG法从其他体液中浓缩胞外囊泡。



Figure 5. ExtraPEG法分离外泌体的效率。





(a)HEK293细胞的共焦显微镜图像。细胞用HEK293细胞或稳定表达CD63-GFP的HEK293细胞提取的外泌体共同孵育24小时。分别用ExtraPEG法和差速离心法获得外泌体。(b)三维图像结合z-stacks。

Figure 6. ExtraPEG法收集的外泌体内含有小RNA。

安捷伦2100生物分析仪用于分析外泌体和细胞RNA。(a)凝胶图将细胞溶解产物、差速离心法和ExtraPEG 法获得的产物RNA按大小分开。(b) 细胞溶解产物、差速离心法和ExtraPEG 法获得的产物RNA电泳图。

作者认为，他们开发的此套方法，不仅提取成本较其他方法廉价，而且有着更高的提取效率，并且在不同体液中均能提取出外泌体。但仍有其需要不断改进的地方。

小编认为，如果不断将外泌体的提取方法优化，有更加完善且平价的提取纯化方法，那可是给研究外泌体的科研人员带来的大大的福音呀~

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