科研老司机谈lncRNA案例分析

Michelle C. Barton团队通过转录组筛选分化过程中的胚胎干细胞的lncRNA发现一个胚胎干细胞特异性的p53调控的lncRNA，命名为lncPRESS1,该lncRNA控制干细胞的命运。...

最新的《Molecular Cell》发表了Michelle C. Barton团队最新lncRNA研究成果。作者通过转录组筛选分化过程中的胚胎干细胞的lncRNA发现一个胚胎干细胞特异性的p53调控的lncRNA，命名为lncPRESS1,该lncRNA控制干细胞的命运。

《Molecular Cell》报道摘要



首先让我们提纲挈领的看看摘要（在速度时代看摘要是科研人员，例如医生和教授同志们首选阅读方式，毕竟事物繁忙，摘要可以简要了解最近科研动态）

最近的证据表明lncRNAs在包括细胞身份确认等许多功能中发挥整合调控作用（lncRNA表达具有时空特异性，lncRNA在细胞身份确认方面本文主要提及的是：什么样的细胞或者组织？什么时间？在什么位置？发挥什么功能？）。作者运用RNA-seq和ChIP-seq技术在经历分化过程的人的胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）中确定了转录组和组蛋白转录后修饰以及p53结合，定义40个高度置信的lncRNA，它们是p53的转录靶标（运用RNA-seq找出差异表达lncRNA，运用ChiP技术找出p53调控lncRNA，两个技术结合找出以胚胎干细胞为目标细胞，在分化过程中的差异的并受到p53调控lncRNA）。作者高度关注分化过程中在多能潜能hESCs中高度表达并受到p53抑制中的lncRNAs，并确定lncPRESS1作为p53调控的转录本，它保持hESC多能潜性与核心多潜能性因子协调一致（运用基因沉默技术将p53进行干扰，将p53动态变化与调控网络核心因子结合起来）。运用RNA-seq技术针对缺乏lncPRESS1的hESCs发现lncPRESS1控制促进多潜能性的基因网络（运用基因沉默技术与RNAseq技术结合将lncRNA进行干扰，将lncRNA动态变化与调控网络结合起来）。此外，发现lncPRESS1与SIRT6物理相互作用，并阻碍SIRT6染色质定位，因此其在多潜能性基因的启动子处保持高水平的组蛋白H3K56和H3K9乙酰化（lncRNA上游是p53，lncRNA下游就是SIRT6,直接相关还是间接相关？证明直接相关，相关后最终赋予了SIRT6功能上的变化影响了组蛋白乙酰化的表观遗传变化）。总之，作者阐述了p53调控的、多潜能性特异的lncRNA通过干扰SIRT6活性来保护hESC状态。（总结陈词，一段摘要涵盖了文章的核心内容，速读以后知道了前因后果机制阐述以及从哪里来到哪里去的功能体现）

lncRNA筛选策略



作者认为创新性研究策略分几大类：

A，临床样品类创新，特色性样品决定了您研究高度；

稀有性、全面性、临床紧迫性的样品让你科研的临床和现实意义拔高你研究的特色和高度

B，机制研究类创新，传承性研究决定了您机制深度；

本文作者长期研究p53调控通路，作者自机制研究具有较高的深度，需要不断传承性系列研究支持课题组研究方向和特色，本文关注点在p53下游lncRNA而已。

C，技术手段类创新，技术手段研发和创新决定了你研究的广度和深度；

技术类创新是最具有创造性和实用性，新的技术手段突破，特别在物理学表现的更加明显，生物学中生物物理学也如此，例如施一公教授蛋白结构研究，蛋白结晶和冷冻电镜技术发展让作者不断有创新性研究成果，而且是源源不断的原创性结果

为了研究受p53调控的胚胎干细胞，通过siTP53和siControl分别处理细胞，然后一组通过RA处理4天，一组不处理的作为对照组，通过RNA-seq发现差异表达的lncRNA，通过ChIP-seq分析p53与染色质结合，最终确定p53调控的lncRNA。

RNA-seq技术和ChIP-seq技术是显著很热门lncRNA研究技术，本文两大技术在目前lncRNA研究极具代表性，特别对于挖掘lncRNA本身及其作用机制。即是用同样的技术手段换一种研究材料和思路，科研工作者同样可以获得高效的研究成果。

RNA-seq转录组测序：研究编码RNA和非编码RNA转录本最热门的技术手段

ChIP-seq:是结合位点分析法，为研究体内蛋白质p53与DNA相互作用论点与论据



科研老司机在文章框架搭建起来以后，就是论点与论据的细化。

作为一个长期从事科研工作者来说，与写自然科学基金标书一样的思路来做课题研究。因此一个研究在开始之前你得写一份项目计划书，写项目计划书也就是要将策略图和机制图画出来，实验进展过程中不断修正你的策略和计划过程中细节。

论点一：在胚胎分化过程中lncRNA受p53调控



作者选择了3条最具代表性的p53调控的lncRNA阐明观点。

1）lncPRESS1,756nt 长链多外显子基因间lncRNA，Ensembl No：ENSG00000232301；

2）lncPRESS2,1238nt 长链多外显子基因间lncRNA，Ensembl No：ENSG00000249152；

3）HOTAIRM1，1052nt 长链多外显子反义转录本lncRNA，Ensembl No：ENSG00000233429；HOTAIRM1是已经报道的HOXA反义转录本，在NB4早幼粒细胞白血病和正常造血细胞的粒细胞分化中上调。HOTAIRM1干扰后功能表明在白血病中HOTAIRM1在HOXA基因簇调控基因表达。

两种诱导胚胎干细胞分化的因子：

RA系维生素A的衍生物，它可以影响脊椎动物的发育和许多类型细胞的分化。RA不但可以通过经典的信号转导途径诱导ES细胞分化，还可以抑制LIF信号促进ES细胞分化。RA常被用来进行诱导多潜能干细胞向神经细胞分化的研究

BMPs是转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）超家族成员中最大的一族，通过调节多种基因活性，对中胚层形成、左右对称、神经系统发生、体节和骨骼发育、肢体形成及肾、胃肠、肺、牙齿的发育等基本过程产生影响。BMPs家族中，BMP-2和BMP-4在诱导ES细胞分化中发挥着重要作用。

图A和图B说明RA和BMP4随着时间推移调控三个lncRNA表达

图C和图D说明RA和BMP4随着时间推移调控三个lncRNA表达明显受到p53调控

Nutlin-3是MDM2拮抗剂，能抑制MDM2和p53的相互作用，IC50为90nM，并激活p53。

图E和图F说明Nutlin-3激活p53后个lncRNA表达趋势证明了p53与lncRNA之间正负调控关系

论点二：在胚胎分化过程中lncRNA受p53调控



通过ChIP数据分析可以看出p53调控三个lncRNA，图D展示了p53结合位点。小编告诉大家赶紧去试试ChIP-seq技术然后借助UCSC平台进行大数据分析，想必这样的数据挖掘工作对你的科研能力培养大大受益！

论点三：单细胞转录组分析受p53调控lncRNA品系特异性表达



这里有个高大上技术就是单细胞技术，为什么选择单细胞技术呢?

同一类型细胞中可能存在很多不同表型及基因型的细胞，单细胞扩增技术通过在单个细胞水平上对基因组进行测序，为科学家研究解析单个细胞的行为、机制、与机体的关系等提供了新方向，广泛应用于：生殖细胞、胚胎干细胞、神经细胞、肿瘤细胞、免疫细胞等热点研究领域。

作者用胚胎干细胞的单细胞，在不同的分化时间点进行分化过程中编码基因和非编码基因表达谱以及它们之间的相关性分析，全面分析表达调控网络。本文作者在技术手段高度上还是足够的！如图A所示，可以看出很好的品系特异性的表达特征性谱图；如图B所示，展示了非编码RNA和编码RNA之间时序性的相关性表达；并且在C图中等到很好的验证效果。

论点四：LncPRESS1影响干细胞的多潜能特性



作者在研究了全局性的变化后着眼点放在单一功能性的lncRNA上。科研老司机方案就是一个课题和一个研究方案最终落脚点在一个关键节点性基因上。

通过针对LncPRESS1进行敲减后进行RNA-seq转录组测序，通过针对上调和下调的差异进行GO分析以及定位分析发现其对干细胞的多潜能性的影响。

论点五：LncPRESS1与SIRT6相互作用调控组蛋白乙酰化



本节点已经进入了lncRNA研究的套路，就是RNA pull down分析lncRNA结合蛋白。小编认为RNA pull down下来这么多，作者选择SIRT6是有前呼后应的故事情节的，一方面RNA pull down数据中SIRT6蛋白丰度高，一方面SIRT6已有研究表明其调控H3K56ac活性控制ESC细胞分化。真好切中要害，作者以此为突破口。通过生物信息学分析找到SIRT6与lncRNA结合位点，通过RIP验证，水到渠成的提出了lncRNA经典作用模式也就是蛋白诱饵（lncRNA decoy），LncPRESS1作为诱饵将SIRT6招募，阻止其与染色质发生作用。

论点六：LncPRESS1参与调控SIRT6引起的6H3K56/K9ac和胚胎干细胞重编程



本研究落脚点在LncPRESS1直接效应分子SIRT6上，深挖ChIP-seq数据（小编提示目前测序和芯片数据如此大量，数据利用和分析才是研究最为关键点）发现在hESC分化过程中多潜能特异性基因的启动子有SIRT6的结合。并且这些基因的启动子H3K56ac和H3K9ac发现显著性变化，通过SIRT6 RNAi也证实了作者的观点。最后一方面机制落脚点在LncPRESS1调控SIRT6调节的H3K56ac/H3K9ac组蛋白乙酰化；另一方面功能上落脚点在hESC重编程过程中LncPRESS1被诱导并发挥重要作用。

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