高效筛选优质细胞系(方法篇)

 

在过去的十年里,采用哺乳动物细胞生产单克隆抗体和重组蛋白,促进了生物治疗蛋白的繁荣。随着竞争加剧,对降低细胞系开发成本以及缩短上市时间的需求变得愈发紧迫。本文概述了细胞系开发的流程,并介绍了高通量筛选方法用于更快、更方便地开发高产细胞系。...





前言:

在过去的十年里,采用哺乳动物细胞生产单克隆抗体和重组蛋白促进了生物治疗蛋白的繁荣。从1986年第一个重组蛋白药物获批到2011年,总共有96个重组蛋白药物获批上市。全球市场从2014年到2019的增长率预计为12.5%,到2019年预计达到39.6亿美元。推动这一发展的关键因素包括:日益增长的单抗药物需求、新颖细胞系技术的出现以及疫苗产量的提升。随着竞争加剧,对降低细胞系开发成本以及缩短上市时间的需求变得愈发紧迫。本文概述了细胞系开发的流程,并介绍了高通量筛选方法用于更快、更方便地开发高产细胞系。

细胞系开发流程:

杂交瘤细胞、CHO细胞以及HEK 293细胞是常见的宿主细胞用于表达重组蛋白药物。开发稳定细胞系的第一步是向宿主细胞转入重组质粒。如果生产的是抗体,传统方法通过将骨髓瘤细胞和B细胞融合获得杂交瘤细胞。这些B细胞通常来自动物,比如小鼠。细胞转染或者细胞融合后,需要筛选大量细胞克隆以获得高表达的细胞(如CHO细胞)或抗原特异性的细胞(如杂交瘤细胞)。一旦确定候选细胞克隆,一系列功能分析将用于确定、验证和表征细胞株。最后,细胞克隆将逐级放大培养,并开展工艺优化。



图1:重组蛋白生产细胞系(A)和杂交瘤细胞系(B)的开发流程。


HAT法筛选杂交瘤细胞 :

杂交瘤细胞来自骨髓瘤细胞和脾细胞的体外融合用于生产抗体。将这两种细胞融合的缘由是脾细胞不能增殖导致难以收集抗体,而骨髓瘤虽然能够增殖却不能分泌抗体。因此,融合获得的杂交瘤细胞兼具两者的特性,能够在体外增殖而持续分泌抗体。在细胞融合过程中,重要的一点是要将杂交瘤细胞从骨髓瘤细胞和脾细胞中筛选出来以提高抗体产量。

脾细胞不能在培养条件下增殖因此可以很容易地被筛除。 骨髓瘤细胞则相对困难,一般利用含次黄嘌呤 (hypoxanthine,H)、氨基蝶呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷酸(thymidine,T)的培养基(即HAT培养基)筛除。其生物学机理为:哺乳动物细胞可以通过两条途径合成核苷酸:生物合成途径(de novo pathway)和补救途径 (salvage pathway)。正常条件下,哺乳动物细胞会采用生物合成途径完成DNA复制。当生物合成途径被抑制时,在 提供次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷酸(T)的条件下,细胞会利用补救途径完成DNA复制。HAT筛选的关键在于选用 HGPRT缺陷的骨髓瘤细胞,而HGPRT是补救途径所必须的一个酶。在生物合成途径被氨基蝶呤(A)抑制的情况下, 骨髓瘤细胞因HGPRT缺陷而不能增殖。杂交瘤细胞从脾细胞获得正常功能的HGPRT酶而能继续增殖。筛选结束后不需要再添加氨基蝶呤(A)。撤去氨基蝶呤的筛选压力后,杂交瘤细胞尚未完全恢复,还需要补救途径以完成复制,因此培养基中需要添加次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷酸(T)。当杂交瘤细胞完全恢复后,HT也可以撤去。
克隆筛选技术 :

转染或融合后得到的细胞群体内存在高度异质性。因此筛选大量克隆以获得高表达细胞系是必需的一步操作。下表比较了常见的几种筛选技术。
快速、强大的克隆筛选系统:

有限稀释法因为低效率而被研究人员逐渐摒弃。自动化可以提高效率、通量,从而缩减细胞系开发时间。ClonePix2系统是一个不错的选择,它能自动筛选大量的细胞克隆。哺乳动物细胞在半固体培养基(如CloneMedia)中形成分离的细胞克隆。ClonePix 2系统逐个挑取克隆从而在一步操作内实现高概率的单克隆性。此外,荧光检测试剂(如CloneDetect)可以直接添加到半固体培养基中从而原位检测分泌蛋白的含量或抗原特异性。ClonePix 2系统利用白光成像检测克隆形态和尺寸(反映单克隆性和生长速率),再利用多通道荧光成像原位定量检测分泌蛋白、细胞膜蛋白,或者抗原的特异性。仪器配套的软件可以根据用户定义的参数(如荧光强度)对克隆进行排序,从而筛选出高表达的细胞克隆。随后仪器可以准确挑取排名靠前的细胞克隆,从而避免有限稀释法带来的误差。












长按识别二维码了解更多


中源生物同MolecularDevices是长期战略合作伙伴
如有相关问题请拨打免费服务电话咨询
400-8100-881
如您对我们的服务有任何的意见和建议请发至如下邮箱
service@sinozhongyuan.com


中源生物

专业服务,助力科技

推动生命科学事业,服务于全人类健康

建立中国最大的生命科学领域产品经销平台


    关注 中源生物


微信扫一扫关注公众号

0 个评论

要回复文章请先登录注册