Cas9-sgRNA-DNA复合物是啥样？

结构很重要...



CRISPR-Cas9系统的开发过程中，张锋和Church是如何设计这个可以用来基因组编辑的工具的呢？这个工具又是长什么样？理解其结构才能更好的理解其工作原理。

我们知道在细菌的II型CRISPR系统中，Cas9行使剪切功能需要crRNA，tracrRNA和RNaseIII共同作用。为了让整个系统更高效，张锋和Church做了一个同样的工作，将crRNA和tracrRNA结合到一起构建到载体中，crRNA-tracrRNA就是我们现在常看到的gRNA；同时，构建Cas9的表达载体。根据研究的目的基因序列，设计crRNA（gRNA sequence）并克隆到gRNA载体中。再将这两个载体共转到细胞中，行使基因组编辑功能。（图1）事实证明，这样的系统很高效。

在这样的系统确定后，结构生物学家么就开始研究Cas9以及其和RNA之间复合物的结构了。在过去几年中，PDB收录的和S. pyogenes中Cas9相关的结构文章有4篇，其中Jennifer A. Doudna2篇，张锋1篇，苏黎世大学的Martin Jinek。找不到文章的可以留言给我email地址。

因为我对于结构了解不多，但是能够明白大概的意思。下面以张锋的文章为例，把相关的图片贴上。



概括来说，Cas9有2个结构域组成：a recognition (REC) lobe 和 a nuclease (NUC)lobe。REC包含3个区域：长的a 螺旋（BH），REC1和REC2。NUC包括：RuvC，HNH和PAM互作结构域（PI），（图2）

Cas9和sgRNA-DNA形成的复合物结构图参考图4。

整个Cas9识别gRNA并剪切的机制为：Cas9识别PAM相邻的区域和sgRNA上面的Repeat:Anti-Repeat Duplex区域（图3），形成Cas9-sgRNA复合物。这个复合物随后和guideRNA和Target DNA一条链互补结合形成的20 bp的结构结合，形成Cas9-sgRNA-target DNA 二元复合结构。其中，PI结构域识别PAM序列，形成R loop结构。之后，HNH结构域和RuvC结构域分别剪切DNA的2个单链，剪切位点为PAM序列上游3个碱基处。（图5）需要说明的是：PAM位点对于Cas9的识别和剪切都起着非常重要的作用。

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