蛋白质检测之免疫共沉淀
一、原理:免疫共沉淀(Co-IP)是以研究蛋白质相互作用的经典方法,其原理基础为抗体-抗原之间的专...
一、原理:
免疫共沉淀(Co-IP)是以研究蛋白质相互作用的经典方法,其原理基础为抗体-抗原之间的专一性作用。在分子病理生物学研究领域,Co-IP是用以确定两种蛋白在完整细胞内生理性相互作用的常用方法。其技术原理为:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来,如果用蛋白质N的抗体免疫沉淀N,那么与N在体内结合的蛋白质M也能沉淀下来。目前多用于精制的蛋白A预先结合固化在琼脂糖的珠子(Beads)上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的蛋白A就能吸附抗原到精制的目的。Co-IP主要用于测定两种目标蛋白质在体内的结合情况,也用于确定一种特定蛋白质的新的结合蛋白。
二、具体步骤:
1. 细胞用预冷的PBS液洗涤2次,最后洗涤完成后吸干PBS液。
2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)。
3. 刮留细胞:用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶中上刮下,将悬液转入1.5mlEP管中,EP管插冰上,置于水平摇床上缓慢晃动15min。
4. 4℃,14000g离心15min。
5. 立即将上清液转移到一个新的离心管中。
6. 准备Protein A琼脂糖,用PBS液洗两遍珠子,然后用PBS液配制成50%浓度。
*为避免操作中破坏琼脂糖珠,减掉移液器枪头的尖部分。
7. 每ml总蛋白中加入100ul Protein A琼脂糖珠(50%),EP管插冰上,置于水平摇床上4℃摇晃10min。
*目的是去除非特异性杂蛋白,可降低背景。
8. 4℃,14000g 离心15min,将上清转移到一个新的离心管中。
9. 测定蛋白浓度,可选用Bradford法做蛋白标准曲线。
10. 蛋白定量,分装,-20℃保存,可保存1个月。
11. 用PBS液将总蛋白稀释至约1ug/ml。
12. 加入500ul稀释好的兔抗到总蛋白中。
13. 于摇床上4℃缓慢摇动抗原抗体混合物,可选择过夜或室温放置2h。
加入100ul Protein A琼脂糖珠用以捕捉抗原抗体复合物,摇床4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或者室温孵育1h。
15. 14000rpm瞬时离心5s,去上清,收集琼脂糖珠-抗原抗体的复合物。
16. 用800ul预冷RIPA buffer冲洗3遍。
17. 用60ul 2倍上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻敲打混匀。
18. 将上样样品煮5min。
19. 14000g离心,收集剩余琼脂糖珠。
20. 将上清电泳,电泳前应再次煮5min变性。
21. 上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳。
三、优缺点
优点:
1.于天然状态下相互作用的蛋白质。
2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响。
3.分离得到相互作用蛋白的天然符合物。
缺点:
1.低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用可能检测不到。
2.两种蛋白质的结合可能有第三者参与,而非直接结合。
实验前预测可能的结合蛋白非常重要,以此选择最后检测的抗体,若预测不准确,实验就得不到结果,方法本身存在风险。
关注 微生物技术应用
微信扫一扫关注公众号