干货：sf9细胞培养的最全指导攻略_【安邦生物】

干货：sf9细胞培养的最全指导攻略...

昆虫细胞培养是用于外源蛋白表达的一种常见方法。对于大规模生产或基础研究，昆虫细胞能够表达大量的有着复杂翻译后修饰的蛋白质。

常用于培养的昆虫细胞大概有两种：sf9和sf21细胞系。

Sf9昆虫细胞系是来自草地贪夜蛾 IPLB-Sf21-AE 亲本细胞系的克隆分离株，它是利用杆状病毒表达系统进行重组蛋白表达的合适宿主。虽然以往人们利用由培养瓶和含血清基础培养基组成的静止培养系统进行昆虫细胞的培养，但是一般而言昆虫细胞并无贴壁依赖性，便于进行悬浮培养。

sf21细胞是从草地贪夜蛾 (秋粘虫) 分离得到的卵巢细胞。该细胞为球型，大小不等，略呈颗粒状外观。Sf21 细胞可解冻后直接悬浮培养，用于细胞库的快速扩增、杆状病毒库的扩增和重组蛋白的生产。由于Sf21细胞与支持物表面贴附牢固，因此可通过单层培养用于转染或菌斑试验。

下面我们主要来讲解一下Sf9细胞培养

Sf9细胞贴壁培养

(1) Sf-9细胞为半贴壁细胞系，在含10%胎牛血清的Grace’s 培养基中通常大部分细胞贴壁生长，另有少部分悬浮。

(2) Sf-9细胞在27°C细胞培养箱生长，不需要CO2。通常生长到80-95%密度时可以分瓶传代。传代时不需要胰酶消化，通过用1mL移液器轻轻吹打贴壁细胞5-10次，待细胞不贴壁即可稀释传代。

Sf9昆虫细胞冻存

(1)待细胞生长到85-90%密度时，用1mL移液器轻轻吹打至细胞悬浮。

(2)用细胞计数板计数，将细胞悬液转移到1.5mL离心管；1000g，离心3min。调整细胞浓度至4-6×106 cells/mL。

(3)取0.5mL细胞悬液加入到2mL冻存管中。

(4)向冻存管中缓慢滴加0.5mL 15% DMSO(含有40%胎牛血清的Grace’s培养基)；使细胞终浓度为2-3×106 cells/mL。

(5)将冻存管管盖拧紧，写好标签，用封口膜封口。

(6)放于程序降温盒，-80°C放置过夜。

(7)立即转移到-196°C液氮中保存。

Sf9昆虫细胞复苏

(1)从液氮管取出装有细胞的冻存管，检查标签。

(2)立即将冻存管放在27°C水浴，避免水没过管帽。

(3)待冻存管细胞中的细胞完全融解后(约2-3min)，转移到细胞房中。

(4)用75%酒精彻底擦洗冻存管，在超净台中打开冻存管。

(5)用移液器把冻存的细胞转移到25cm2细胞培养瓶中，然后缓慢滴加27°C预热的10%含血清培养基。

(6)放于27°C细胞培养箱生长，24h后更换新鲜细胞培养基。

昆虫细胞培养注意事项

昆虫细胞传代的一般步骤与哺乳动物细胞相同，但是这些培养系统的一些关键要求有所不同。

1.昆虫细胞应于 27°C、非湿化环境中培养。培养昆虫细胞时建议不要进行二氧化碳交换，故培养瓶是密闭盖。

2.使用昆虫细胞专用的培养基；

3.贴壁昆虫细胞：细胞密度低于汇合状态的 20% 时，细胞生长会受到抑制。健康状态最好的细胞是对数期收获的细胞，故昆虫细胞应在对数期传代。但是，如果培养的是强贴壁性昆虫细胞，则应在细胞达到汇合状态或者刚刚开始从培养瓶底部脱离时进行传代，因为此时细胞容易脱离。

4.某些昆虫细胞系可能需要一定的过程来适应悬浮培养。进行细胞悬浮培养时无需更换培养基。定期传代时需要吸出细胞悬液，然后加入适量培养基，将细胞稀释到适当的密度。添加新鲜培养基后可使细胞营养素达到完全补充。

5.贴壁昆虫细胞在无血清培养条件下，昆虫细胞与基质贴附极为牢固，需要花费较大力气才能使其脱落。要使细胞脱落，可以采用拍掌的动作快速振摇一下培养瓶。为了避免污染，进行此操作前必须盖紧盖子。

警告：建议不要剧烈摇晃培养瓶，因为这样可能会造成细胞损伤。

昆虫细胞培养基

昆虫细胞培养基的发展经历了天然培养基、合成培养基和无血清培养基三个阶段。应用较多的是合成培养基即Grace’s昆虫培养基加10%澳洲胎牛血清。同时在抗体生产上，也会利用无血清培养基即在已知细胞所需营养物质和贴壁因子基础上，在基础培养基中加入适宜的促细胞生长因子，能够保证细胞生长良好无须补加血清的培养基如康宁的hybrigro SF无血清培养基。

电子版昆虫细胞培养手册：

包括Sf9、Sf21和H5昆虫细胞以及提供相关昆虫细胞生长和维持的一般信息。

Sf9、Sf21和H5细胞系适于用杆状病毒或其他昆虫表达系统表达重组蛋白。

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