清华大学：利用ARTP技术和ABE共生系统基因重排技术提高丁醇产量_【清华研究院生物育种中心】

清华大学张建安副教授、刘宏娟副教授团队采用ARTP诱变育种技术与ABE共生系统的基因重排技术再次完美结合...

继江南大学毛忠贵教授团队利用ARTP诱变育种技术完美结合基因重排与核糖体工程成功得到了ε-聚赖氨酸产量提高51%的超高产白色链霉菌后，本期推荐的是清华大学张建安副教授、刘宏娟副教授团队采用ARTP诱变育种技术与ABE共生系统的基因重排技术再次完美结合，获得了高产丁醇的由丙酮丁醇梭菌和蜡状芽孢杆菌组成的微氧耐受系统TS4-30。该系统丁醇产量达到15.63 g/L，较原系统TSH06提高34%。本次研究成果于2017年成功地发表在国际主流期刊《Applied Microbiol Biotechnol》上（文章题目：ARTP mutation and genome shuffling of ABE fermentation symbiotic system for improvement of butanol production）。

自70年代石油危机引起世界各国对未来能源短缺的重视以来，生物能源备受关注，可再生的生物丁醇成为研究的热点。然而在丁醇的研究中存在丁醇产量低、丁醇菌株缺乏对氧的耐受性等问题，约束了产业化发展。

清华大学张建安副教授、刘宏娟副教授团队也一直从事该领域研究，在丙酮丁醇梭菌生产丁醇中取得了巨大的进步。前期他们采用丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum TSH1和蜡状芽胞杆菌B.cereus TSH2两株菌构建了丁醇共生体系TSH06，使TSH1在非厌氧的环境下能够生产丁醇，且其产量与原始菌株相近，克服了微氧耐受性的问题。为了使丁醇共生体系TSH06的产丁醇能力达到大规模工业生产要求，他们利用TSH06作为原始菌进行常压室温等离子体（ARTP）诱变，随后又进行了4轮基因组重排（GS），获得了优良的ARTP丙酮丁醇梭菌突变株。由于该突变菌株缺乏对氧的耐受性，在研究中他们再次引进了丁醇共生体系TSH06中的B.cereus TSH2，得到了突变共生体系即微氧耐受系统TS4-30，最终，其产丁醇的能力达到了15.63g/L，较原系统TSH06提高34%。

为了进一步阐明代谢机理，他们将ABE发酵过程中的关键酶基因ak、pta、bk、ptb、ctf、thl、hbd、adhE、bdhA和bdhB分别进行酸化阶段和溶剂形成阶段的转录水平分析。与原始菌株相比，在酸形成期TS4-30中有机酸生成的关键酶基因（bk，ptb，pta，ak）受到抑制，其mRNA表达减少；而溶剂形成期，溶剂生成的关键酶基因（adhE，bhdA，bdhB）表达量全部增加。这些关键酶基因在TS4-30中的表达模式与发酵产生高丁醇、低酸的性状相吻合；也进一步展现了ARTP在育种领域的可塑性价值，同时再次印证了ARTP与其他育种技术结合的有效性及其巨大的应用潜力。

文章精选内容如下：

1、ARTP诱变实验

图1 致死率曲线，a图功率为120W，b图功率为100W

2、ARTP诱变突变体发酵

图2 ARTP突变体的发酵

ARTP诱变的突变菌与原始菌TSH6进行37°C发酵比较（均提供蜡状芽胞杆菌TSH2），A0-1、A0-2产生的丁醇浓度比TSH6高，A0-3总溶剂比TSH6高，A0-4、A0-5正丁醇溶剂浓度低于TSH0-6。A0-1、A0-2、A0-3被选择用于基因重排。

3、菌种改造与共生体系构建流程

图3 突变株和蜡状芽孢杆菌TSH2的共生系统的重建

实验过程大部分在厌氧环境中进行；共生体系A0-X由ARTP突变菌与TSH2组成，其中X为序数变量；GS为基因组重排；Gn-x为基因重排突变体，TSn-x为基因重排菌Gn-X与蜡状芽胞杆菌TSH2的共生体系，n=1-4轮GS的数量。

4、TSH06 与TS4-30的发酵过程比较（a TSH06. b TS4-30）