电化学发光测定原理

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         电化学发光免疫测定

              

                                      

电化学发光免疫测定

电化学发光反应：电化学发光（electro－chemiluminescence，ECL)是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光两个过程。化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+(图1）和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面同时各失去一个电子发生氧化反应（图2）。二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，后者是一种强氧化剂。TPA被氧化成阳离子自由基TPA+*（参见图2），后者很不稳定，自发地失去一个质子（H+），形成自由基TPA*，这是一种非常强的还原剂。这两个高反应基团在电极表面迅速反应，三价的[Ru(bpy)3]3+被还原形成激发态的二价[Ru(bpy)3]2+*，能量来源于[Ru(bpy)3]3+和TPA*之间存在的高电化学电位差。TPA*自身被氧化成二丙胺和丙醛。接着激发态的   [Ru(bpy)3]2+*衰减成基态的[Ru(bpy)3]2+，同时发射一个波长620nm的光子。这一过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号得以增强。





二、电化学发光免疫测定

以三联吡啶钌作为标记物，标记抗原或抗体，通过免疫反应及ECL反应，即可进行电化学发光免疫测定（ECLIA）。在实际应用中则尚有特定的仪器和试剂。瑞士罗氏公司（ROCHE）的ElecsysECLIA系统，综合了各种先进技术，具有独特的优越性，已在医学检验中取得广泛应用。

Elecsys全自动分析仪分成两个部分：在试管内化学反应部分和在流动池内的ECL反应部分。

（一）试管内的化学反应

1、试剂的组成

在Elecsys试剂的制备中，包括电化学发光剂的标记和抗原或抗体的固相化，应用了多种先进技术，简述如下：

（1）电化学发光剂的标记

[Ru(bpy)3]2+需经化学修饰形成活化的衍生物后才能与抗体或抗原形成结合物。有多种活性基团可与[Ru(bpy)3]2+分子中的砒啶基反应。在Elecsys试剂中采用的是N羟基琥珀酰胺酯（NHS）（图1）。该衍生物具有水溶性，可与抗体、蛋白质抗原、半抗原、激素、核酸等各种分子结合形成稳定的标记物。而且[Ru(bpy)3]2＋NHS分子量很小，与免疫球蛋白结合的分子比超过20仍不会影响抗体的可溶性和免疫活性。

（2）固相载体

Elecsys中采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8mm的聚苯乙烯微粒。其特点是表面积极大，吸附效率高；在液体中形成均匀的悬液，参与反应时类似液相，反应速度快。由于带有磁性，在游离标记物与结合标记物分离时，只需用磁铁吸引，方便迅速。

（3）链霉亲和素与生物素系统的应用

链霉亲和素（streptoavidin，SA）和生物素（biotin，B）是具有很强的非共价相互作用的一对化合物。一分子SA可与4分子B相结合。在Elecsys的试剂中，SA通过特殊的蛋白结合物均匀牢固地包被在磁性微粒上，形成通用的能与B结合的固相载体。另一试剂为与经活化的B衍生物化合的抗原或抗体。两种试剂混合时，B化合的抗原或抗体即结合在磁性微粒上。

2、在试管中的反应

反应分两个步骤。以双抗体夹心法测抗原为例，试剂含以下组分：

a、[Ru(bpy)3]2+标记的抗体

b、生物素化合的抗体

c、SA磁性微粒

d、TPA溶液

e、洗涤液

（1）步骤一

在试管中加试剂a、b及待测标本（含抗原），反应式如下（图3）。反应在液相中进行，37oC下5－10分钟内完成。



（2）步骤二：在上述反应液中加入试剂c，反应式如下（图4）。

反应在接近液相的条件中进行，37OC下5－10分钟内完成。下一个步骤为结合的标记抗体与游离的标记抗体相分离，此步骤及以下的电化学发光反应，在Elecsys的流动池中进行。



（二）流动池中的电化学发光反应

1、流动池的基本结构

流动池是电化学发光过程中所有电化学发光反应进行的场所（图5）。反应液由蠕动泵运送入流动池，反应后由流动池流出。一个激发电极在流动池的下方，两个测定电极安装在激发电极上方的两侧，留出一个清晰的窗口以便使发射的光子被光电倍增管收集。在流动池下装置可移动的用以吸引磁性微粒的磁铁。



2、电化学发光反应的步骤

（1）将试管内两步反应结束的反应液输入流动池，由于磁铁吸引，磁性微粒被吸着在电极上，其余反应物流出流动池，完成游离的和结合的标记抗体的分离。

（2）将TPA溶液送入流动池,将残余的游离标记抗体排出流动池,在流动池中充满TPA溶液。

（3）撤下磁铁，电极上通电，三联吡啶钌与TPA发生电化学发光反应，发出的光被光电倍增管收集，测定光强度。

（4）通过换算得出待测标本中的抗原浓度。

（5）在流动池中送入清洗液，将反应物彻底冲洗，即可测定下一个标本。

一、    主要技术特点

1、电化学发光反应原理

化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+和电子供体（TPA）在阳极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，这是一种很强的氧化剂。TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA+*，它很不稳定，可自发地失去一个质子（H+），形成自由基TPA*，这是一种很强的还原剂，可将一个电子递给三价的[Ru(bpy)3]3+使其形成激发态的[Ru(bpy)3]2+*。激发态的三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+*不稳定，很快发射出一个波长620nm的光子，回复成基态的三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+。这一过程可以在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号增强。

2、电化学发光的标记物

电化学发光的标记物-三联吡啶钌的分子结构简单，分子量小，可以标记于任何抗原、抗体及核酸，在一个抗体等分子上可同时标记>20个标记物分子，不影响抗体的活性，用于核酸标记亦不影响探针杂交活性。三联吡啶钌是水溶性，高稳定的小分子，它可以确保电化学发光的高效性和稳定性，并无噪音干扰。

3、专利的包被技术

罗氏公司应用了专利的链霉亲和素-生物素包被技术。链霉亲和素-生物素是最牢固特异的结合，因此可以达到牢固和均一的包被效果。一个链霉素亲和素可以和四个生物素结合，因此可以成倍增加生物素化抗体（抗原）的包被量，具有信号放大的作用，提高了检测灵敏度。

4、独特的载体

由聚苯乙烯包被的直径为2.8微米的磁性微球作为载体，大而均一的表面积能包被最大量的链霉亲和素，载体悬浮在反应体系中，使异相反应类似均相反应，大大加快反应速度。

5、磁性分离技术

使用磁铁将结合标记抗原抗体复合物的磁性微粒（结合相）吸附于电极上，而游离相则由缓冲液冲走，电极表面的电化学发光的信号检测完成后，磁铁移走并使用系统清洗液冲走电极表面的结合标记抗原抗体复合物的磁性微粒（结合相），为下一次测定做准备，由于测量池清洗彻底，避免了交叉污染，实现了结合相和游离相的全自动化分离。

6、超越7个数量级的测定线性

发光信号检测的宽线性加上电化学发光独特的标记物本身（发光底物）循环发光和专利的链霉亲和素-生物素包被技术的信号放大做用使电化学发光测定的线性范围最大超越7个数量级。

7、电化学发光试剂的稳定性

电化学发光的标记物三联吡啶钌在无电场和递电子体（三丙胺）存在的自然环境下非常稳定，因此用它标记的抗原（抗体）试剂也非常稳定。

8、超高的测定灵敏度和线性

先进的检测原理和应用技术配合高特异和高亲和力的抗体试剂，在待测抗原（抗体）极微量或达到期病理极限时，均能准确测定，避免了样本稀释重测定。

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