掌握这 8 点令 PCR 引物设计事半功倍

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临门一脚，先讲核心，掌握核心，引物设计任你驰骋。

引物长度

引物长度对反应特异性、解链温度、退火时间都有较大的影响，最终影响到 PCR 反应是否成功。多数情况下，引物长度约 18~30bp, 引物太短会导致非特异扩增，太长虽然会增加特异性，但是二级结构（如发夹结构）出现的概率增大。

引物的解链温度

PCR 反应的特异性很大程度上依赖于引物的解链温度（Tm 值）。多数 PCR 反应最优的解链温度应在 55~60℃，如果没有其他不稳定因素，引物的 Tm 值取决于它的长度、序列组成和浓度，离子强度的影响可以忽略不计，因为不同的 PCR 反应盐浓度变化不大。

一个反应中所有引物的解链温度应尽可能接近。对于多数 PCR 反应而言，引物之间的差应小于 2~3℃。差值增大，反应效率会降低，甚至直接导致反应失败。因为 Tm 值髙的引物在低于退火温度的条件下错配，而 Tm 值低的引物在髙于退火温度的条件下与模板只有低浓度结合。

可利用以最近邻热力学理论为基础的公式估算 Tm 值，该理论分析了复式解链的热力学过程。

Tm = [△H/△S-RIn(c)]-273.15（公式 1）

复式构成物中焓变（△H）和熵变（△S ）可借助于最近邻热力学参数计算，为摩尔气体常数，c 为寡核苷酸的物质的量浓度。该分析可确定特定的焓和熵对复式构成物的自由能的影响，该影响由序列中的「最近邻」造成。最近邻从 5' 末端起始，焓和熵的效应是加性的。在式（1）中加人另一个条件，以经验性地计算盐对复式构成物的稳定性的影响。

Tm =[△H/△ S + R In(c)] - 273.15 + 12.0lg[Na+] （公式 2）

大多数引物设计软件都使用 Breslaner 或 SntaLucia 最近邻参数系统估算寡核苷酸复式构成物的 Tm 值（Breslauer et al. 1986; SantaLucia 1998)。

对于由 20 个或更少个碱基组成的短序列，可用 Wallace 原理计算其第一位近似值。该公式假定盐的浓度为 0.9 mol/L，这是斑点杂交分析的常用浓度。

Tm = 2℃ * (A + T) + 4℃ * (G + C) （公式 3）

一般来说，退火温度比引物解链温度低 5°C。但是，根据这一原则得出的退火温度常常并不是最优的，必须通过实验获得最优温度。利用梯度热循环仪很容易实现这一目的。另外，可利用更精确的公式计算乃值（最优退火温度）（Rychliketal.1990)。

Ta = 0.3 * 引物 Tm 值 + 0.7 * 产物 Tm 值 - 25 （公式 4）

复制子的解链温度

除了计算引物的解链温度以外，还要保证产物的解链温度要足够低，以保证其在 92℃ 时完全解链。一般来说，100~600bp 的片段可以有效扩增。该参数有助于使 PCR 效率更高，但并不总是成功的 PCR 所必需的。产物的 Tm 值可根据（式 5）计算。

Tm = 81. 5 + 16. 6*(lg10[K+])+0.41(%G+C) - 675/长度 （公式 5）

二级结构

设计引物时，另一个需要考虑的重要因素是二级结构的存在。一个带有自身同源序列的引物可以回折形成部分双链的发夹结构。类似地，引物之间的同源可能引起引物二聚体的形成。PCR 反应时，相对于模板而言，引物浓度髙很多，引物之间相互退火要比引物与模板之间退火容易得多。因此，引物如果存在发夹结构或者二聚体，对于 PCR 扩增往往是致命的，因为这样会导致非特异的大量背景产物的扩增。避免出现二级结构的最简单的方法是：选择 GC 含量约 50%、四种碱基中缺少一种的引物。

重复

同一碱基或几个核苷酸的重复也应尽量避免。不同的重复对 PCR 反应的影响见表 1。

GC 夹

在引物的 3'端包含一个 G 或 C 残基可增加引物扩增效率，这就是所谓的「GC 夹」。它可以促进引物的 3'端正确地结合到模板，因为 GC 夹可以形成更为稳定的氢键，因此可以提髙扩增的特异性。以胸腺嘧啶结尾的引物的特异性有降低的趋势。

高 GC 含量片段的扩增

为了扩增高 GC 含量的 DNA，应该设计 Tm 值（最好为 75~80℃) 较高的引物。髙 GC 含量的 DNA 双链完全解开所需的温度明显较一般的 DNA 高。温度较低时，PCR 复制子的两条单链有较快地重新退火的趋势，可与引物退火相互竞争。因此，PCR 过程中退火温度较髙有助于引物退火，因此可以提髙扩增效率。

非目标同源

应利用 BLAST(http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 程序对引物序列进行检索，查询是否有竞争性序列与其交叉同源或基因组中是否有别的位点与其同源，这种同源序列将导致引物错配和产生非特异的扩增产物。‍