宝宝长大后该分家了--单抗制备之亚克隆

杂交瘤宝宝在96孔里快乐成长，那长大了之后还有哪些故事要发生呢？好宝宝，坏宝宝该分家了！！！本期给您带来亚克隆的那些事。...



两星期没发抗体制备相关文章了，小伙伴们是不是等急了。那咱们接着上一期的内容往下讲，完成了细胞融合并且明白了杂交瘤的筛选原理后，就该进行检测筛选和亚克隆了。对啊，杂交瘤细胞宝宝在96孔板里长了近半个月，是时候把他们放出来透透气了，下面小编就要讲讲怎么去寻找我们需要的乖宝宝（阳性克隆）以及怎么获得纯正血统的乖宝宝。

在融合后第3-4天就可以用新鲜的HAT培养基换液，此时96孔里已经有很多死细胞的尸体了，必须及时处理掉，要不然你的杂交瘤宝宝就不能快乐成长，吃“成长快乐”也没救啊。融合后的10天左右就可以挑克隆，观察每孔里的细胞克隆数目，并在盖子上标记好，此时就可以改用HT培养基来换液了。96孔里的细胞克隆长满至视野的一半（大概也就两个星期的样子）就可以检测了。一般都是采用直接ELISA法，这里小编重点提醒的是二抗，最好使用特异识别小鼠IgG的二抗，小编使用的是Jackson家的，等到最后筛出来的抗体里面有IgM、IgA啥的就头大了，这些抗体亲和力不好，且不好纯化。还得啰嗦两句，就是检测前对融合板的换液，因为在融合板里未融合上的脾细胞会存活一段时间后才会离我们而去，这段时间里它也不会闲着，照常分泌抗体，如果不对96孔板换液，那么势必会对检测结果造成影响（假阳性孔偏多），严重的就是检测出现蓝板，最好是换液3次左右，稀释脾细胞分泌的抗体，降低检测的背景值。

根据检测结果的不同，有不同的亚克隆策略，最终的目的还是为了获得阳性单克隆细胞株，小编姑且将检测结果分为如下几类：

1、阳性孔很多，多到什么程度呢，每块板上有20个以上，如果碰到这种情况小伙伴是不是很头疼，幸福来的太突然？没事，小编很负责人的告诉你里面绝大多是假阳性，这种情况多半是二抗特异性不好或者融合板换液次数太少造成的。针对此类情况的处理方法就是，用HT培养基把所有阳性孔全部扩大培养到24孔板中，长个三四天再检测。还一个方法是，将融合板换液后过个一两天再检测。

2、阳性孔适中，一般每块板上5-20个阳性孔，此时就需要根据阳性孔里面细胞的生长情况来处理了。为保证实验进度，可以先挑选细胞状态好（高颜值）检测值高的单克隆孔直接亚克隆，对于细胞克隆一般大的阳性孔可以扩大培养到24孔中先，再做打算。对于细胞克隆较小且状态不是很好的阳性孔，可以直接将细胞吹出亚克隆铺到96孔板中培养。

3、阳性孔较少，此种情况是每块板上阳性孔在5个以下，总数在20个以下，那就是没的选啦，全部都亚克隆上吧，同时需要将阳性孔细胞株保存在24孔中，原始孔补液，以防克隆板和24孔中细胞长不起来。

扯了这么久亚克隆，那具体的操作到底是咋样，莫急，容小编一一道来。小编一般会根据96孔里细胞克隆的大小不同而采用不同的方法，主要有两种：

倍比稀释法 

若阳性孔里细胞克隆大小不到孔底面积的十分之一或者更小的，采用此法，细胞数目较少不好计数。具体操作是，用150ul左右的培养基在孔里将细胞吹起悬浮，取50ul左右（具体多少可根据细胞克隆大小而定）加到4ml培养基中稀释混匀，取2ml铺到96孔板的前两列，再向剩余的2ml中添加2ml新的培养基稀释混匀，取2ml铺到96孔板的第三、四列，依次类推直到铺满96孔板。一般此法第一次亚克隆板中都会有单克隆长出，但单克隆孔的数目不多。

计数法 对于阳性孔中细胞克隆大的一般都采用此法，用100ul培养基将细胞吹出，加到900ul培养基中稀释混匀，计数（具体计数方法在细胞融合那一期有讲到），根据计数结果做一定比例的稀释，取200个细胞左右加到10ml的新鲜培养基中吹打均匀铺板。不出意外，此法第一次亚克隆每块板都能获得较多的单克隆，具体还要看细胞宝宝的生长情况。

此外还有几点小编需要提醒：

1、对于细胞克隆较大的阳性孔一定要把亚克隆剩下的细胞转移到24孔中培养；

2、第一次亚克隆所用的培养基一定要是含HT的20%的胎牛血清完全培养基（此时的细胞宝宝还很脆弱，营养一定要给足，万一宝宝不开心，离你而去，这比失恋还痛苦啊）；

3、亚克隆所用的96孔板一定要提前铺好饲养细胞（可参考单抗制备第二期内容）。

亚克隆完成后就是等啦，等这些分了家的宝宝们长大，然后就又是检测、分家（亚克隆）、检测、分家（亚克隆），直到检测结果为全部阳性。因为前期杂交瘤细胞还不稳定，会出现染色体丢失的情况，就会造成阳性克隆丢失，所以亚克隆的过程也是让细胞稳定下来的过程，不同的细胞株情况也不一样，有的就是很多次才能全阳稳定下来，这只能耐心等了，科研是寂寞的，实验是要经得起煎熬的啊。奉上一段亚克隆的操作视频，可能与实际操作有所出入，大家可以做个参考。

（视频来源：BioNetwork    剪辑：小录）

今天就先嘚吧嘚吧到这，小伙伴们如有什么疑问、建议都可以留言或者联系我们，小编定会耐心解答，同时也欢迎各位小伙伴与小编进行交流。考虑亚克隆涉及到ELISA操作，这也是单抗制备中重复率最高的实验操作，因此下一期小编将给大家讲讲ELISA方面的心得体会，尽请期待！！！

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