Nature子刊：lncRNA 的trans调控机制

lncRNA调控机制cis/trans，怎么选，怎么入手，Nature自刊给你启示。...



lncRNA的调控机制多种多样，但归结起来，lncRNA在细胞核中最常见的作用下游靶基因的方式就是cis和trans靶基因调控。今天，小编和大家分享一篇最近发表《Nature Structural & Molecular Biology》上的研究，来学习下经典的trans调控机制。

研究背景

肝癌（HCC）是一种常见的恶性肿瘤，与病毒感染，代谢疾病等密切相关。肿瘤细胞干性（CSC）是认识肿瘤异质性的关键点，因此，深入研究肝脏CSCs，能有助于我们理解HCC发病机制及为其治疗提供依据。本研究从肝脏CSC自我更新调控相关的lncRNA出发，揭示了lncRNA通过trans调控机制参与其中。

研究结果

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筛查HCC和肝CSCs特异性表达lncRNA

通过对HCC来源CSC和non-CSCs细胞样本全基因组差异表达lncRNA检测，发现有286个差异显著lncRNA。进一步的肿瘤样本验证与TOPFlash 荧光素酶系统验证显示，lnc-β-Catm是一个与Wnt-β-catenin signaling相关的lncRNA（该研究想找与Wnt-β-catenin相关的lncRNA）。

接下来，研究人员用knockdown验证了lnc-β-Catm抑制oncosphere形成的能力，RACE实验验证lnc-β-Catm的全长信息。进一步的细胞定位显示，lnc-β-Catm在HCC细胞的细胞核中。因此，lnc-β-Catm是一个在HCC肿瘤组织和肝CSC细胞中高表达的lncRNA。

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lncRNA生物学功能分析

第一步筛选到了lncRNA，接下来就要对其引起的生物学表型进行验证。通过在不同的HCC肿瘤细胞系中敲降lnc-β-Catm，进行裸鼠移植处理，发现肿瘤的自我更新能力受到抑制，肿瘤增殖也受限。因此，lnc-β-Catm的敲降会破坏CSC细胞的多能性。

同时，对在HCC细胞中过表达lnc-β-Catm，发现可以促进oncosphere形成，肿瘤致瘤性增强。因此，lnc-β-Catm是一个促进CSC自我更新和肿瘤增殖过程的lncRNA。

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lncRNA作用机制分析

找到差异，找到表型，接下来的工作就是研究lncRNA的具体分子作用机制了。研究人员没有发现lnc-β-Catm在基因组上的位置附近有功能基因出现。因此，lnc-β-Catm可能不是通过cis调控，而是trans调控下游靶基因。通过RNA pulldown实验，研究人员发现lnc-β-Catm可以结合β-catenin和EZH2。结合区域分析显示，lnc-β-Catm的9片段（1938-2281）和6片段（1188-1437）能分别与之结合。同时，co-IP实验也表明，在oncosphere细胞中，β-catenin和EZH2可以结合，且主要在细胞核中。此外，RNA 免疫共沉淀也显示，lnc-β-Catm和β-catenin，EZH2形成复合体。

有了上述结果，接下来就要进一步研究他们之间的结合关系。Domain mapping实验表明β-catenin的N末端和EZH2的N末端是两者结合必需的，同时也是与lnc-β-Catm结合的必要条件。当在oncosphere细胞中加入lnc-β-Catm时，其与β-catenin的结合增强。

多梳蛋白（Polycomb）通过调控组氨酸甲基化影响细胞干性，而EZH2又是多梳蛋白抑制复合体2（PRC2）的组成部分，那么，EZH2是否影响β-catenin的甲基化呢？抗体检测显示，在CSCs细胞中，β-catenin处于甲基化状态。当用EZH2的抑制剂GSK126和GSK343处理oncosphere细胞时，β-catenin甲基化减弱；当在HCC中过表达EZH2时，β-catenin甲基化程度增强。此外，体内甲基化检测也显示，lnc-β-Catm能促进其甲基化。进一步的实验也验证，EZH2影响了β-catenin N端K49位点的甲基化。

当Wnt信号通路失活时，β-catenin磷酸化，然后被泛素化降解。当Wnt通路激活时，β-catenin降解复合体失活，β-catenin进核，甲基化而稳定。因此，在CSCs中，这个过程是怎么实现的呢？结果显示，在PLC spheres和primary spheres中，EZH2过表达可以减弱β-catenin的磷酸化水平，其稳定性增强。而抑制剂处理后，β-catenin磷酸化水平降低，K48-linked泛素化水平增加。进一步实验验证β-catenin甲基化后抑制其泛素化。

已经把与lnc-β-Catm结合的两个蛋白之间的调控关系说明白了。那么，lnc-β-Catm又是怎么样调控CSCs细胞的自我更新过程呢？结果显示，HCC spheres中的lnc-β-Catm depletion可以抑制Wnt信号通路基因的表达。同时，促进β-catenin的磷酸化和泛素化，减弱其稳定性。当lnc-β-Catm敲降时，β-catenin甲基化减弱，过表达时，β-catenin甲基化增强。过表达后EZH2抑制剂处理，没有促进oncosphere形成。因此，β-catenin的甲基化过程需要有活性状态的EZH2存在，这对于CSCs的自我更新也是必需的。

运用CRISPR-Cas9系统，研究人员建立了lnc-β-Catm敲除细胞系，进行补救实验。结果显示，Knockout lnc-β-Catm后，Wnt-β-catenin信号通路失活，β-catenin甲基化减弱，磷酸化和泛素化增强。当加入β-catenin补救时，甲基化增强，磷酸化和泛素化减弱。另外，对Wnt通路靶基因MYC，CCND1和PTTG1进行补救时，都可以修复sphere形成。当处理Wnt-β-catenin信号通路抑制剂WIKI4时，lnc-β-Catm过表达引起的肿瘤细胞sphere形成也会恢复。而用Wnt-β-catenin agonist处理则是相反的结果。因此，lnc-β-Catm促进CSC自我更新过程是依赖于Wnt-β-catenin信号通路通过促进β-catenin稳定性实现。

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lnc-β-Catm和Wnt信号通路的临床意义

通过分析lnc-β-Catm表达与临时数据，研究人员发现其表达和疾病的不同stage相关。同时，高表达病人有着不良的预后。病人中，高表达lnc-β-Catm，伴随着高甲基化，低磷酸化β-catenin，Wnt-β-catenin激活。此外，在HCC肿瘤组织中，研究人员检测到了高的EZH2表达水平和Wnt-β-catenin靶基因表达水平。因此，lnc-β-Catm，EZH2，Wnt-β-catenin靶基因的表达水平与HCC的疾病严重程度与预后显著相关。

小编点评

为什么要从trans调控入手研究lncRNA，找到lncRNA结合的蛋白后如何深入研究他们之间的作用关系，这些是这篇高分文章区别与其他常规lncRNA研究的几个亮点。本研究通过大量详细的实验结果，向我们展示了lncRNA是如何通过trans调控机制影响CSC的自我更新能力，其研究思路和实验方法非常值得大家细细揣摩。

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