《Genome Biology》：当circular RNA遇到单细胞测序……

CircularRNA(circRNA)是一类来源于RNA转录本，以环状形式广泛存在的具有调控功能的非编码RNA。单细胞测序是研究生命现象的全新技术，为我们开启细胞精细功能研究提供了新的平台。当单细胞测序技术运用于circRNA测序......



circular RNA(circRNA)是一类来源于RNA转录本，以环状形式广泛存在的具有调控功能的非编码RNA。这几年的研究发现，circRNA在生命体发育过程和疾病过程中发挥了重要的作用。单细胞测序是研究生命现象的全新技术，为我们开启细胞精细功能研究提供了新的平台。当单细胞测序技术运用于circRNA测序，会有什么新的发现呢？今天，小编和大家分享一篇近期发表的关于对植入前胚胎的单细胞circRNA测序，来了解下circRNA在胚胎发育早期中的角色。



研究结果

为了探究胚胎在植入前发育过程中全基因组的转录本表达模式，研究人员对七个不同发育阶段的细胞（成熟卵母细胞，受精卵，2细胞，4细胞，8细胞，桑椹胚，囊胚），运用SUPeR-seq技术，进行了polyA+ mRNA和polyA-RNAs测序。PCA结果显示，不同同时期的胚胎有着明显的差异。

通过ERCC归一化分析，平均每个卵母细胞有66M个的mRNA拷贝数，但是在受精后减少到平均29M个的拷贝数，在8细胞期减少到最少的15.7M个拷贝。而过了8细胞期后，mRNA的表达又开始逐渐上升，到囊胚期又增加到150M个拷贝。

不同时期细胞表达差异分析显示，有5573个卵母细胞来源基因在4细胞期显著下调，有7427个合子激活基因在4细胞期后显著上调（包括ZP家族基因，POU5f1，TETs基因）。

circRNA是一类polyA-RNAs，通过CIRCexplorer分析软件，共鉴定到来源于2974个母基因的10032个exonic circRNAs。进一步的Sanger测序和RNase R处理实验也确认了测序结果的可靠性。在植入前胚胎发育的过程中，circRNAs的拷贝数变化范围在28774个到190008之间。有56%的母基因可产生多个circRNAs分子（hot-spots），每种类型的circRNAs拷贝数平均有92个。在猪胚胎脑组织中发现的hot-spot基因CSPP1，在植入前胚胎细胞中也产生了最多的circRNAs转录本（46个）。有99%以上的circRNA也不是有第一个和最后一个外显子成环而来，有一个circRNA有56个外显子组成。

统计分析显示，circRNAs的平均长度在124-227bp之间，暗示着能形成circRNA的母基因至少在200bp以上。同时，circRNA的侧翼内含子也都比较长，上游平均8.7kb，下游平均7.5 kb。

深入分析显示，在成熟的卵母细胞中，circRNAs占据了所以转录本的9%，这个比例在4细胞期前一直比较稳定。在8细胞期，circRNAs比例占到了25%。circRNA/母基因的比例为10%，有些circRNA表达水平显著高于线性RNA。其中5个典型基因（PRDM2，SETD2，MLLT3，MLLT4和KIT）参与了一些重要生物学过程：组氨酸甲基化，转录调控。

此外，研究人员将能产生circRNA的母基因与其他基因进行了比较。结果显示，8细胞期之前，母基因表达显著高于其他基因，8细胞期后，母基因显著低于其他基因。另外，2974个母基因根据表达模式可以分为三类：1554个卵母来源基因，851个合子基因，还有569个其他类型。通过对环状和线性进行比较（CLR），发现卵母来源基因CLR值逐渐上升，特别在8细胞期之后。circRNAs在MZT过程中，circRNA相对卵母来源的线性mRNA更加稳定。通过对circRNAs和线性mRNA的表达模式分析，可以看到两者一直处于负相关的表达趋势。

通过对2974个母基因进行功能富集可以看到，发育早期GO terms主要集中在染色体重组和转录。桑椹胚期高CLRs的母基因GO terms主要是细胞周期和核分化。总的来说，这些结果表明，大部分的circRNA母基因主要是卵母细胞来源基因，circRNA相对线性mRNA更能抵抗母源线性RNA的衰减过程。

为了增加对circRNAs进化过程的理解，研究人员比较了人和小鼠中胚胎植入前circRNAs表达的差异。结果显示，在小鼠中发现的1316个circRNAs母基因，有63%都能够在人中找到，表明circRNA的产生在人和小鼠中是高度保守的。对人的2974个circRNA母基因GO分析显示，主要是器官组织基因，染色质组织，细胞周期过程，与小鼠的母基因富集结果高度吻合。因此，circRNA在人和小鼠中的形成是高度保守的。

值得注意的是，人的circRNA母基因数量远远高于小鼠的母基因（2139 vs 481），当在相同的测序深度的情况下比较时也是一样（795 vs 285）。在胚胎发育早期，无论是circRNA还是母基因，人的数量都高于小鼠。在发育的不同阶段，人和小鼠的circRNA母基因表达模式也是高度一致的。

研究人员把人和小鼠胚胎中都高表达的circRNA母基因进行了分析，发现人的明显高于小鼠（526 vs 134）。另外，分析侧翼内含子的长度也显示，人的侧翼序列也明显比小鼠长。因此，人的植入前胚胎中circRNAs相比小鼠来说更加复杂。

通过de novo分析，研究人员鉴定到2322个新的潜在转录本和10084个潜在isoforms，平均长度为1052 bp。这些新基因相比已知基因有更多的内含子，一半以上有两个外显子组成。此外，这些基因的平均表达水平比在只用polyA+ mRNAs单细胞测序时更高，表明这些基因没有polyA或者只有很短的polyA尾巴。这些新的转录本在8细胞期前表达持续上升，但之后就开始下降。此外，通过蛋白编码能力预测，研究人员发现这些基因中，有89.9%的基因没有显著的编码潜能，表明这些新发现的基因可能是潜在的lncRNA。

研究结论

该研究运用SUPeR-seq技术，鉴定到了植入前胚胎发育不同阶段，细胞内circRNAs和基因的丰富表达模式，为我们理解circRNAs在生命早期过程中的重要作用提供了新的见解。该研究无论从技术手段还是研究对象上，都是最新最前沿的，为我们理解生命的神奇开辟了新的道路。

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