RNA中的“甄嬛”--环状RNA之功能验证

据说，RNA并不仅仅是DNA与编码蛋白之间一个平凡的信使；据说，环状RNA不是一类普通的RNA。今天小编跟大家一起去看一看环状RNA的功能探究，揭开它的神秘面纱。...





提到环状RNA，可谓是继lncRNA之后的又一明星分子，备受人们的宠爱，它神秘的生物调控作用受到越来越多的关注。先扫盲，什么是环状RNA？

环状RNA (circular RNA，circRNA) 是一类广泛且多样地存在于哺乳动物细胞中、具有调控基因表达作用的内源性RNA分子。刚开始，它并没有受到重视。

circRNA 最早于20 世纪70 年代在RNA 病毒中被发现，但是在当时并未引起人们的重视。近年来，随着高通量测序技术和生物信息技术的广泛应用，人们发现了数以千计的circRNA。其中，大部分circRNA主要来自编码基因的外显子，也可能来自编码基因的内含子、基因间区、UTR区域或非编码RNA基因位点。

于是乎，好学的小编就想到了一些问题，

比如，在做完circRNA-seq之后，会得到一些差异表达的circRNA，在这些circRNA中会有我们感兴趣的circRNA，so，对这些关注的circRNA如何去做功能验证，揭开它的神秘面纱？

于是乎，小编查找了一些资料，在这里分享给大家（不用谢，请叫我红领巾）。

一、表达水平的定量验证：q-PCR

实时定量PCR 技术可以对不同组织、不同处理、不同发育阶段的基因表达差异进行实时检测，检测不同基因在细胞表达中的丰度、RNA（mRNA和ncRNA）
的分析表达和分析基因的表达等研究，具有特异性强、灵敏度高和快速等特点。

circRNA定量验证手段与常规PCR手段不同，常规手段是围绕目的片段的上下游分别设计PCR引物，而对于circRNA引物，可以分2种方式设计：对于外显子环化circRNA，引物跨剪切位点（backsplice）设计，需要特异性针对backsplice junction位点处设计primer；对于内含子环化circRNA，可跨剪切位点设计，也可围绕内含子区域设计引物。除此之外，circRNA引物设计建议还需要满足扩增产物长度不超过100bp。参见下图。

通过qPCR，可以对测序结果得到的差异表达水平进行验证，使结果更准确可靠。对于这些circRNA的功能研究，我们可以通过过表达或敲除此类circRNA来研究其功能。

二、功能验证：circRNA过表达

circRNA过表达思想主要源于circRNA生物形成机制，已有多篇文章报道circRNA成环机制，目前比较公认的成环机制为circRNA侧翼序列的碱基互补配对，称之为Alu结构，如图2。

基于circRNA侧翼Alu序列特征，PCR扩增含侧翼Alu序列的目标DNA序列，随后依据对应限制性内切酶位点进行酶切，进而连接pEGFP-C1载体。连接载体进而转染对应细胞样本，定量PCR检测转染效率。基于divergent primer验证circRNA过表达倍数。

过表达策略：

1、扩增目标区域包含circRNA侧翼Alu序列或内部碱基互补序列，侧翼上下游1kb处过表达效率更佳；

2、目标区域扩增基于基因组DNA为模版。

三、功能验证：circRNA敲除

circRNA敲除思路主要针对circRNA backsplice junction处序列信息设计siRNA，对于内含子环化circRNA，也可针对内含子区域设计相应siRNA进行干扰。

敲除策略：

1、外显子环化circRNA，针对backsplice junction位点前后序列设计siRNA 。

2、内含子环化circRNA，除针对backsplice junction位点前后序列设计siRNA序列以外，也可针对内含子区域序列设计siRNA。

3、每个siRNA设计对应的对照，backsplice junction位点一端互补配对，另一端错配。

以上是对环状RNA验证的几种方法，后续小编会继续呈上更多环状RNA的动态，满足大家对环状RNA的喜爱之情。

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