标记引物位点

SNP标记不会使用和验证，怎么办？

别急，图谱君这就送上实用小软件~...

近期图谱君下市场转悠了一圈，发现一个普遍的问题：众科研汪们对于基于高通量测序开发的SNP标记的使用及后期验证仍然有些迷茫，针对这些问题，图谱君稍稍整理了下，干货这就送上，希望对大家有所帮助。

首先，普及几个基本的概念。

1. CAPS标记、dCAPS标记的定义及区别

CAPS标记：

基于SNP的PCR技术与RFLP技术结合的分子标记技术，简单理解就是某SNP恰好位于酶切位点上，通过对该SNP位点设计引物，经PCR后获得的相应产物片段经酶切、电泳等步骤，最终通过观察不同的条带判断样本的多态性。

dCAPS标记（衍生的酶切扩增多态性序列）：

CAPS标记衍生的分子标记，通过引物引入错配的碱基，从而构建或者去除限制性内切酶识别位点的标记技术。

2. 注意事项

用CAPS 或dCAPS 的方法可以将几乎所有的SNP位点转化成以PCR 为基础的分子标记；
dCAPS引物的设计是将SNP转化为dCAPS的关键，错配碱基离引物3'端的距离远近对标记开发成功与否有着重要影响，有文献支持错配碱基在3'端第二位或者更远位置设计出来的引物更佳。

Duang ，重点来了！引物设计~

CAPs标记引物的设计主要通过2大步骤来完成：

第一步：寻找CAPs标记位点

第二步：针对CAPS位点进行引物设计

目前关于CAPs标记位点的寻找，有一款可以进行批量寻找的软件，软件下载地址为http://pgrc.ipk-gatersleben.de/snp2caps/ 该软件更新于16年5月份，更新相对是比较及时的。操作简单易懂，主要步骤如下：

1. 寻找CAPs标记位点

准备工作：

1）软件下载地址：http://pgrc.ipk-gatersleben.de/snp2caps/

下载页面展示：

2）软件使用时必须下载使用最新酶信息

限制性内切酶数据库（REBASE）：文件下载(GCG-format data file, downloadable from http://rebase.neb.com)

3）输入文件

格式为：题头（>id seqname）+序列，举例如下：

标记寻找：

1）软件页面展示：

2）工具栏中打开File文件，选择REBASE data ，将已经下载的最新的酶数据库上传，此时页面显示如下：

3）快捷方式将所有酶选择后，单击Select，有页面会被添加用于分析的酶，或者根据自己的需求选择相应的酶。

4）上传多比对文件：

5）参数选择：默认即可

6）Run analysis

7）结果展示及说明：

2. 针对CAPS位点进行引物设计

有了caps位点，引物设计就不是难点了，直接使用primer 3.0或5.0都可以，相信大家都可以轻松搞定。

最后，图谱君再简单说下dCAPs引物设计dCAPs引物设计：

目前未见到批量设计的版本，对于少数引物的设计可以使用dCAPS Finder 2.0 .

下载地址为：http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html