【Nanoscopy技术篇III】结构光照明荧光显微镜（Structured Illumination Microscopy）

本章小编将介绍一类重要的活细胞超分辨技术：基于结构光照明实现的结构光照明荧光超分辨显微镜（structuredilluminationmicroscopy,SIM），其有两种具体的实现形式：（1）线性SIM以及（2）非线性SIM。...



写在前面的话：由于小编前一段时间在补论文的各种审稿实验、参加Focus on Microscopy会议，加上小编对结构光照明荧光显微理解不够深刻，因此本期基于结构光照明荧光显微成像的博文迟到了一个多月，望各位看官谅解。也希望各位看官喜欢本期基于结构光照明的超分辨技术！

前两章里，小编介绍了两类主流超分辨技术：STED类超分辨技术和单分子定位类超分辨技术（PALM/STORM），那么还有一类重要的活细胞超分辨技术则是基于结构光照明实现的结构光照明荧光超分辨显微镜（structured illumination microscopy, SIM），其有两种具体的实现形式：（1）线性SIM（2倍理论分辨率的提升）；（2）非线性SIM（2倍以上理论分辨率的提升）。在此，不得不提的是SIM的发明人，Mats Gustafsson教授，在此，小编深深地为Gustafsson教授的“英年早逝”感到惋惜。

在前面的章节里，小编说过STED 技术可以在小视野范围内得到更高的时间分辨率和空间分辨率，同时具有较高的成像深度；而PALM/STORM 类型的超高分辨率成像技术可以得到超高的空间分辨率，同时利于单分子定量计数，但是它们的缺点也很明显：需要很强的激发光来照明样品。通常地球上的生物体受到的太阳的辐射在 0.1 W/cm^2，而STED 和 PALM/STORM通常所需要的辐射在103~108 W/cm^2，相当于一千个到一亿个太阳的照射。在这种情况下，荧光蛋白/分子很容易被漂白，产生大量的自由基损伤活细胞样品。

另外，超分辨成像的核心在于ON-OFF，从另一个角度而言，假设荧光光子数恒定，那么SIM 成像的方法则是并行度最高的，最有效地利用荧光分子所发出的光子；正因为并行度高，所以大大降低了其所需要的照明功率，在过去几年里被证明成为活细胞超高分辨率成像的利器。

在SIM成像中，物体（包括荧光标记与非荧光标记的样本）被非均匀的结构光（类似于条纹码）所照明。在实验中, 不同相位和方向的结构光依次照明物体，它们和物体在不同角度混频所产生的摩尔条纹被相机依次采集并解码（提取高频分量）生成超高分辨率的图像。最终重建的SIM图像具有高于传统显微镜图像2倍的空间分辨率。因此，小结一下，SIM成像的核心有两个方面：（1）结构光的产生；（2）SIM图像的重构算法。

对于结构光的产生，实际实验过程中在照明光路中插入一个空间光调制器（如光栅，或者数字微镜阵列DMD等），照明光受光栅的调制后经物镜投影在样品上，这样在样品的焦平面收到调制光的照射，在远离焦平面也不受影响，最终调制光所产生的荧光信息通过成像系统被CCD接收。其简易光路如下所示：对于SIM图像的重构算法（包括2维SIM和3维SIM），其核心在于通过傅里叶变换将空间域和频域进行变化。空间频率难以可视化，高频信息对应尖锐的变化，而缓慢变化的结构则对应低频信息。高频信息对应的空间域信息则为高分辨信息。（具体的重构方式可以阅读参考文献《结构光照明荧光显微镜突破衍射极限的原理和在生命科学中的应用》，小编在此不重复描述）对于非线性SIM而言，则是通过更强的照明，使荧光信号饱和，使得荧光和照明光不再符合线性关系，等效荧光信号近似于矩形形状，从而包含更高频的调制频率，这样我们可以通过傅里叶变化，提取更高频率的信息（3倍频及以上）。最早实现这一技术的同样是Mats Gustafsson教授（Gustafsson M G L. Nonlinear structured-illuminationmicroscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimitedresolution[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America, 2005）。后来，通过开关蛋白的方式，他进一步优化了非线性SIM技术，达到50nm左右的空间分辨率（Rego E H, Shao L, Macklin J J, et al. Nonlinearstructured-illumination microscopy with a photoswitchable protein revealscellular structures at 50-nm resolution[J]. Proceedings of the National Academyof Sciences, 2012）。

在此不得不提的是去年Eirc Betzig组的一篇Science文章，中科院生物物理所李栋研究员和Betzig教授利用商业化的超高数值孔径的油镜（NA 1.7），实现了更高分辨率的线性SIM成像，其分辨率达到84 nm。利用这个技术，他们观察了活细胞内的网格蛋白小窝以及细胞内不同的骨架蛋白的精细动态变化过程。同时他们也通过结构光激活、结构光激发模式的非线性激发实现更低功率的活细胞非线性SIM成像（45-62 nm空间分辨率）。（Li D, Shao L, Chen B C, et al. Extended-resolution structured illuminationimaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science, 2015, 349: aab3500）



（左图：利用线性SIM解析clathrincoated pit & actin骨架蛋白；右图：TIRF, 线性SIM，非线性SIM解析actin骨架蛋白）

得益于SIM超分辨成像技术对探针要求少，时间分辨率高、荧光光子利用率高，以及光学传递函数高频（高分辨率）区域透过率高等优点，在过去的10年里，SIM已经广泛地应用到生物学领域中，例如，经典的文章有2008年德国科学家利用多色3D-SIM成像技术观测细胞核内结构（Schermelleh L, Carlton P M, Haase S, et al. Subdiffractionmulticolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illuminationmicroscopy[J]. Science, 2008）；



此外，SIM还被用于结合Bessel light-sheet fluorescence microscopy（贝塞尔片层光显微），提高贝塞尔片层光显微成像的空间分辨率。（Planchon T A, Gao L, Milkie D E, et al. Rapidthree-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam planeillumination[J]. Nature methods, 2011 & Gao L, Shao L, Higgins C D, et al. Noninvasiveimaging beyond the diffraction limit of 3D dynamics in thickly fluorescentspecimens[J]. Cell, 2012）



那么，我国在结构光照明荧光显微成像领域的现状如何？

目前据已发表的文章及小编所知，国内结构光照明荧光显微成像还处于起步阶段，多个课题组对结构光照明荧光显微成像起到了重要的推动作用，主要有：

（1）   中科院生物物理所李栋研究员组，其在国际上首次利用高NA物镜实现82nm分辨SIM，并实现PA NL-SIM的活细胞非线性SIM成像（Science 2015）。

（2）   中科院光机所姚保利、雷铭组首次提出并实现了基于数字微镜器件（DMD）和LED照明的SIM技术（Scientific Reports 2013）以及高分辨率彩色三维SIM图像（ScientificReports 2015）。

（3）   北京大学席鹏研究员组公开了SIM的成像算法（IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics 2016）；

（4）   北京大学陈良怡教授组研究开发SIM成像新技术，并将其应用到生物问题中；

（5）   中科院苏州生物医学工程技术研究所武晓东研究员等系列团队开发SIM成像新技术；

（由于小编见识有限，不全之处还望谅解~）

参考文献：

1. Gustafsson M GL. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescenceimaging with theoretically unlimited resolution[J]. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America, 2005, 102(37):13081-13086.
2. Gustafsson M GL, Shao L, Carlton P M, et al. Three-dimensional resolution doubling inwide-field fluorescence microscopy by structured illumination[J]. Biophysicaljournal, 2008, 94(12): 4957-4970.
3. Rego E H, ShaoL, Macklin J J, et al. Nonlinear structured-illumination microscopy with aphotoswitchable protein reveals cellular structures at 50-nm resolution[J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 2012, 109(3): E135-E143.
4. Fiolka R, Shao L,Rego E H, et al. Time-lapse two-color 3D imaging of live cells with doubledresolution using structured illumination[J]. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences, 2012, 109(14): 5311-5315.
5. Li D, Shao L, Chen B C, et al.Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic andcytoskeletal dynamics. Science, 2015, 349: aab3500
6. 吴美瑞, 杨西斌, 熊大曦, 等. 结构光照明荧光显微镜突破衍射极限的原理和在生命科学中的应用[J]. 激光与光电子学进展, 2015, 52(1): 17-27.
7. 陈良怡. 运用结构光照明的活细胞超高分辨率成像技术[J]. 中国科学: 生命科学, 2015, 9: 009.

[P.S. 在此，小编对孙育杰研究员、李栋研究员对本章的校对表示感谢！]

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