【shbio文献】玉米转录组测序研究新成果一篇~
上海大学的研究人员通过对Opaque2的酵母双杂交（Yeasttwo-hybridscreening）...
上海大学的研究人员通过对Opaque2的酵母双杂交（Yeast two-hybrid screening）技术对其互作蛋白进行筛选以及功能分析，从而对Opaque2调控下游基因的表达的理论模型做出了进一步的解释和完善。该研究成果已经被国际著名学术期刊杂志PLOS Genetics接收，即将在线发表。该研究是上海大学通信学院的博士研究生乔祯逸在宋任涛教授和生命学院青年教师祁巍巍博士的指导下完成的。该研究中RNA-Seq服务由上海伯豪生物技术有限公司提供。
研究思路
1.研究人员利用酵母双杂交技术对O2蛋白的互作蛋白进行筛选，以期望能够拓展O2在籽粒发育时期起到的作用机制。在酵母双杂交实验中，研究人员筛选到一个属于MADS类转录因子家族的蛋白ZmMADS47，并且该蛋白与O2之间的互作通过GST Pull-down、coIP以及凝胶过滤实验的验证（见下图）。
2.ZmMADS47与O2的表达谱分析 研究人员对ZmMADS47的全长蛋白以及分段蛋白进行了转录激活能力的检测。结果发现， ZmMADS47的C端不保守结构域则表现出了极强的转录激活能力（见下图）。该结果中，ZmMADS47全长则仅仅表现出了较弱的转录激活能力。这可能是由于ZmMADS47的C端转录激活结构域被全长包裹其中使得其转录激活能力的不到释放，而在酵母体系中又缺乏一些能够使其转录激活能力得以释放的因子，从而导致ZmMADS47全长在酵母中相对于玉米籽粒天然状态中的构型与修饰存在差异，从而影响了全长的转录激活能力。
3.ZmMADS47 RNAi株系的转录组表达谱分析
为了对ZmMADS47 RNAi后整体基因表达水平进行一个大致的了解，研究人员使用了上海伯豪的玉米mRNA高通量测序服务对ZmMADS47 RNAi籽粒的模式进行转录组层面的研究。GO归类后发现，差异基因主要被归类于营养储藏类（表一）。
4.ZmMADS47 RNAi籽粒的表型观察
qPCR、SDS-PAGE、Western-blot对醇溶蛋白RNA和蛋白水平的研究发现，α-zein和50-kD γ-zein的积累量都出现了一定程度的下降。但与o2突变体的opaque表型不同的是，ZmAMDS47 RNAi籽粒中并没有出现明显的opaque表型（见下图）。
5.蛋白体大小与形状在ZmMADS47 RNAi籽粒中发生变化
研究人员对ZmMADS47 RNAi籽粒进行了透射电镜的观察，结果表明，突变体的蛋白体大小分配上出现变化，并且部分蛋白体出现畸形（见下图）。
6.ZmMADS47可以结合醇溶蛋白启动子
研究人员对ZmMADS47和醇溶蛋白启动子的体外结合研究发现，ZmMADS47可以结合α-zein和50-kD γ-zein的CATGT启动子，并且和O2一同调控醇溶蛋白的表达（见下图）。
7.ZmMADS47促进O2调控醇溶蛋白表达
ZmMADS47与O2瞬时转化洋葱表皮细胞后发现，ZmMADS47本身单独不能激活下游靶标，而与O2一同转化后，则可以不同程度的增加下游靶标的转录激活能力（见下图）。
8.O2释放ZmMADS47的转录激活能力
研究人员通过对ZmMADS47，O2以及50-kD醇溶蛋白的突变研究表明，O2可以通过和ZmMADS47的蛋白互作释放ZmMADS47 C端的转录激活能力，从而促进下游醇溶蛋白的表达（见下图）。
本研究中，研究人员通过对Opaque2蛋白的酵母双杂交筛库筛选到了一个MIKC亚类的MADS类转录因子ZmMADS47。对ZmMADS47进行RNAi后的转录组研究发现，ZmMADS47同样对醇溶蛋白存在着调控关系。体外DNA－蛋白互作（EMSA）实验证实ZmMADS47对α醇溶蛋白以及50-kD γ-zein有着直接结合。ZmMADS47与Opaque2的瞬时转录激活测试表明，Opaque2可以释放ZmMADS47的转录激活能力，从而一同增强对α醇溶蛋白以及50-kD γ醇溶蛋白的调控。该研究成果不仅大大拓展了人们对玉米籽粒醇溶蛋白调控机制的认识，还对植物MIKC亚类MADS类转录因子在植物发育过程中的生物学功能有了进一步的延伸。
原文出处：Qiao ZY, Qi WW, Wang Q, et al. ZmMADS47 regulates zein gene transcription through interaction with Opaque2. PLOS Genetics.2016.
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