siRNA转染操作指南

RNA干扰（RNAi）在哺乳动物细胞中的应用，给功能基因组学领域带来了革命性的变化。其所具有的简单、有效的下调哺乳动物细胞中特定基因表达的能力，在科学、商业和医疗领域有着潜在的巨大应用。siRNA高效转染是有效沉默基因的关键。...



RNA干扰（RNAi）在哺乳动物细胞中的应用，给功能基因组学领域带来了革命性的变化。其所具有的简单、有效的下调哺乳动物细胞中特定基因表达的能力，在科学、商业和医疗领域有着潜在的巨大应用。siRNA高效转染是有效沉默基因的关键。



RNA干扰实验中的脱靶效应

研究表明，siRNA转染会导致脱靶效应，即siRNA影响了非同源性基因或者半同源性基因的表达。脱靶效应包括mRNA降解、翻译抑制或者诱导干扰素应答(5–8)。脱靶效应的机制目前还不完全清楚。可能是由于siRNA和与目标mRNA具有高度同源性的mRNA相互作用，或者是由于siRNA发挥了和miRNA相似的功能，还可能是由于细胞对于siRNA毒性的应激反应。除此之外，一些研究者还观察到了siRNA诱导的干扰素应答。

脱靶效应能导致RNA干扰实验中的错误结果。研究认为，使用低浓度的siRNA能够很大程度上避免脱靶效应。

siRNA转染的优化

计算siRNA浓度

一个双链，20 nt长度的siRNA分子的一些近似数值：

· 20 µM浓度的siRNA大约相当于0.25 µg/µl

· 21核苷酸长度的siRNA的分子量大约为13–15 µg/nmol

为确保最佳的贴壁细胞siRNA转染效果，建议优化以下参数。

siRNA的量

siRNA的量对于有效转染和基因沉默是非常关键的。对于所使用的每一种细胞类型和siRNA的组合，都应该优化转染试剂和siRNA的比例。

转染时的细胞密度

对于每一种要转染的细胞类型，应该确定其转染时的最佳的细胞汇合度，并且在以后的实验中保持恒定。这可以通过在接种前对细胞进行计数来实现。在使用传统方案的情况下，可以通过在接种常数和转染常数之间保持时间间隔来实现。这样可以确保细胞的密度不是太高，并保证细4胞在转染时维持最佳的生理状况。

不同形式的细胞的接种数量的准则显示在下列表格中：贴壁细胞接种的典型数目、悬浮细胞和巨噬细胞接种的典型数目以及原代细胞接种的典型数目。

贴壁细胞接种的典型数目

培养容器规格

快速正向转染或反向转染（转染当天）

传统实验方案（转染前一天）

384孔板

4000–10,000

2000–5000

96孔板

1–5 x 104

0.5–3 x 104

48孔板

2–8 x 104

1–4 x 104

24孔板

0.4–1.6 x 105

2–8 x 104

12孔板

0.8–3 x 105

0.4–1.6 x 105

6孔板

1.5–6 x 105

0.8–3 x 105

60 mm培养皿

0.3–1.2 x 106

1.5–6 x 105

100 mm培养皿

2–4 x 106

1–2 x 106

悬浮细胞和巨噬细胞接种的典型数目

培养容器规格

建议接种的细胞数

96孔板

3–6 x 104 悬浮细胞

24孔板

1–2 x 105 悬浮细胞

96孔板

1–6 x 104 巨噬细胞

24孔板

0.4–2 x 105 巨噬细胞

96孔板

3–6 x 103 分化巨噬细胞

24孔板

1–2 x 104 分化巨噬细胞

原代细胞接种的典型数目

培养容器规格

建议接种的细胞数

96孔板

20,000

48孔板

40,000

24孔板

60,000

12孔板

120,000

6孔板

200,000



多孔板转染——制备预混液

如果你在多孔板上进行转染，则需要制备转染复合物预混液或者转染试剂和培养基质（取决于实验方案）的预混液以便注入孔板的小孔中。

· 在制备预混液之前，计算所需的每一种成分的体积以及总体积。

· 准备比需要的量多10%的预混液以避免移液错误（也就是说，对于一个48孔板，准备足够53个小孔使用的预混液）。

· 用一个可重复使用的移液器来分配预混液。

进行合适的RNA干扰对照实验

进行合适的对照实验是非常重要的，只有这样，才能够正确地解释实验结果。我们推荐下列对照实验。

阳性对照siRNA

这种siRNA是指已经明确知道能高效率敲除目标基因的siRNA。阳性对照用来确定转染实验和敲除分析的实验设置能在最佳的状态下工作。如果一个siRNA所敲除的基因能影响正在研究的表型，那么这个siRNA也应该用做阳性对照，以确保对表型的评估能在最佳状态下工作。在每一个RNA干扰实验中，都应该转染阳性对照siRNA。

阴性对照siRNA

阴性对照siRNA应该是不具有基因沉默效果的siRNA，并与所有已知的哺乳动物基因都没有同源性。转染阴性对照siRNA是为了确定表型和基因表达的改变是否是非特异性的。在每一个RNA干扰实验中，都应该转染一个阴性对照siRNA。

转染对照siRNA

这种对照组是为了测定转染的效率。转染的效率可以通过几种不同的方式来测定，比如在转染荧光标记的siRNA之后使用荧光显微镜检测，或者在转染影响细胞存活的必需基因的siRNA之后，观测细胞的死亡水平。这种对照应该用于实验参数的优化，比如，当对一个新的细胞系进行RNA干扰实验时。

Mock转染对照

Mock转染对照中的细胞经历完整的转染过程，但是并不加入siRNA（也就是说，细胞仅用转染试剂处理）。这种对照实验是为了排除任何由转染试剂或者转染过程所引起的非特异性现象。

未转染细胞对照

应该对未经处理的细胞进行基因表达的分析，以便测定正常水平的基因表达。未经处理的细胞的分析结果可以与所有其它样本的结果相比较。在每一个RNA干扰实验中都应该对未经处理的细胞进行分析。

用于表型确认的额外的siRNA

敲除基因对表型的影响必须用至少一个额外的siRNA进行确认。这个额外的siRNA应该以mRNA的不同区域作为靶标。

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