Western Blot 常见问题与详解

你想知到如何选择0.2um还是0.45um孔径的PVDF膜吗？封闭液选用BSA还是脱脂奶粉？当出现高背景、低信号或者非特异性条带时，会存在哪些情况？如何解决？让我们带着这些问题的答案，快乐轻松地做好westernblot吧！...



各位小伙伴们，又到了开学季，又得进入忙碌的实验室生活啦，德慧聚生物为大家精心准备了western blot常见问题与详解，你想知到如何选择0.22um还是0.45um孔径的PVDF膜吗？封闭液选用BSA还是脱脂奶粉？当出现高背景、低信号或者非特异性条带时，会存在哪些情况？如何解决？让我们带着这些问题的答案，快乐轻松地做好western blot吧！

确保样本充分裂解，预防蛋白降解

Western  Blot流程的第一步是进行样本制备，首先建议尽可能地使用新鲜样本，从源头保证实验结果。样本制备时建议采用细胞裂解/组织匀浆和超声破碎相结合的方法，目的是让样本破碎更彻底，蛋白得到更充分的释放。

检测膜蛋白或胞浆蛋白建议选择普通的裂解液，检测核蛋白，建议使用更强的RIPA裂解液。值得注意的是在样本裂解时，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白降解；检测磷酸化蛋白还需要加入磷酸酶抑制剂。

转印的影响因素

1.转印方法的选择:主要有槽式转印（湿转）和半干转印，干转印三种方法。槽式转印适合所有蛋白，转印效率最佳；半转印适合分子量较小的蛋白，省时，省试剂；干转印时间最短，但是针对高分子量蛋白转印效率较低。

2.膜的选择：用于Western Blot的膜主要有NC膜和PVDF膜。NC膜的蛋白结合力为80-110ug/cm2。PVDF膜灵敏度，分辨率和蛋白亲和力比常规的NC膜要高，蛋白结合力为125-200ug/cm2。根据蛋白分子量大小选择不同孔径的膜，大于20KD的蛋白用0.45um孔径的膜，小于20KD的蛋白用0.22um孔径的膜。

3.实验操作注意事项:使用PVDF膜的时候需要放入100%甲醇中1分钟预先活化; 膜上面不要有油脂类的东西,否则会影响蛋白结合和抗体杂交; 转印时滤纸—膜-胶-滤纸三明治结构中避免出现气泡。

封闭液的选择对于Western Blot检测非常重要，建议针对不同的抗体，选用合适的封闭液，以便有效降低非特异性结合，提高一抗与抗原的结合，提高信噪比和灵敏度。

以下几种情况要避免使用牛奶封闭液：1) 抗山羊的二抗：因为抗山羊的二抗可能会识别牛奶中含有的IGg,导致高背景。（建议使用BSA）

2) 检测磷酸化蛋白:牛奶中含有磷酸化的酪氨酸可能会带来高背景。（建议使用BSA）

3) 生物素-链霉亲和素检测系统：牛奶含有内源性的生物素，当使用链霉亲和素检测时，会带来较高的背景。（建议使用BSA）

 

现象：背景高

原因：

1. 封闭液中有BSA。

解决办法：  封闭液中的BSA可能会造成膜的高背景，加入SDS降低背景/更换封闭液。

2. 没有使用合适的封闭液。

解决办法：选择效果最好的封闭液

3. NC膜背景高

解决办法：抗体稀释中加入Tween-20降低背景

4. PVDF膜背景高

解决办法：使用低背景荧光PVDF膜。建议加入SDS（终浓度0.01-0.02%）Tween-20（终浓度0.1-0.2%）

5. 抗体浓度过高

解决办法：对一抗、二抗浓度进行优化

6. 洗涤不充分

解决办法：增加洗涤次数，洗涤液体积，确保洗液中含有0.1% Tween-20

7. 抗体体积不足

解决办法：在抗体孵育中，增加抗体体积，保证整个膜浸入在buffer中，避免膜干燥

8. 膜污染

解决办法：使用干净的镊子，孵育时使用干净的器皿，袋，托盘

现象：背景不均匀，有污斑，斑点

原因：

1. 多张膜同时封闭时，封闭液体积不足

解决办法：增加封闭液体积，保证每张膜都能接触到足够的封闭液

2. 膜浸润不完全/膜某些区域干燥

解决办法：如果使用PVDF膜，一定要首先进行活化

3. 镊子、器皿污染

解决办法：使用干净的镊子、器皿，袋

4. 扫描区域/硅胶垫不干净

解决办法：清洁扫描区域/硅胶垫

5. 做标记时没有使用合适的笔

解决办法：使用铅笔做标记

现象：信号弱

原因：

1.没有使用合适的封闭液

解决办法：不同的封闭液会影响一抗的效果

2.抗体结合/孵育不充分

解决办法：

l 可能抗体亲和力较低，增加抗体浓度/选用不同来源的抗体

l 增加抗体孵育的时间，例如室温4-8小时/4℃过夜

l 一抗/二抗贮存时间过长

3.去垢剂太多

解决办法：降低抗体稀释液中去垢剂浓度如Tween-20/SDS浓度，SDS建议浓度0.01-0.02%

4.蛋白转印不充分

解决办法：

l 需要确认转印液，转印程序是否正常

l 通过预染Marker对转印进行质控；转印后对胶进行染色并确保没有蛋白残留

5.蛋白质没有很好地结合在膜上

解决办法：

l 转印后将膜在空气中干燥1-2小时，有助于蛋白与膜的不可逆结合

l 转印buffer中的SDS会干扰蛋白质与膜的结合，尤其是干扰低分子量蛋白质，尽量避免使用/降低SDS浓度。建议SDS浓度最多为0.05%

l 低分子量蛋白质在转印时容易转过，建议使用小孔径的膜/减少转印时间

现象：非特异性条带

原因：

1. 抗体浓度太高

解决办法：

l 降低抗体浓度/抗体孵育时间。增加抗体稀释液中Tween-20浓度

二抗稀释液中添加/增加SDS

2. 没有使用合适的封闭液

解决办法：封闭液会影响背景，选用合适的封闭液

3. 抗体发生交叉反应

解决办法：

l 使用合适的二抗；降低二抗浓度

l 避免同时使用种属来源相近的抗体（如来源于大鼠和小鼠的一抗，来源于山羊和绵羊的一抗）否则可能发生交叉反应

如果您觉得此文很有价值，欢迎转载到朋友圈，让更多小伙伴实验室生活更简单。

点击历史消息，获得更多实验技巧

    关注 德慧聚生物