宏基因测序后怎么验证？除了qPCR还能做...

思想碰撞出火花~...



最近论坛有位网友Watson提出了疑问：鉴于现在只做测序难发文章，16s及宏基因组测序做完后，有什么验证方法？是挑几个做qPCR吗？或者有什么其他方法？



这是一个很好的问题，现在测序后如何验证是个关键。我们给精彩回复的网友奖励了奥币（一分耕耘一分收获，筒子们又可以任性地用云平台工具啦喂~），大家也是为Watson操碎了心，这里摘选出精彩的回答~

fengqiu一般而言，宏基因组测序是一种技术手段，测序后应该是想和生物学功能进行结合，回归和解决生物学问题。所以这个问题不能一概而论，要和具体的实验目的结合起来综合分析。

采用宏基因组学的方法可以揭示微生物群落的组成、结构、群落功能等， 这些结果可以说是对整个“微生物库”的反映，但并没有直接揭示这些微生物在环境中具体发挥了哪些生态学或生物学功能。

要客观全面地解决这一问题，还需要结合微生物类群数量、qPCR/dPCR基因定量、宏转录组学、宏蛋白组学、纯培养验证等手段综合研究并加以分析。此外，除了分子手段，还可以从生理生化水平进行分析，可以检测微生物的酶活，可以对特定类群的微生物的功能进行分析，也可以检测元素的含量变化，比如做碳氮循环研究，可以采用同位素示踪方法进行深入分析。

总之，目前的技术手段很丰富，可以根据自身的实验目的，找到相应的技术方法，最终解决生物学问题。

这位网友fengqiu提出了总体思路，并列举了几个验证方向，还是非常有借鉴意义的。而另一位网友山大辰星提供了如何做培养验证的方案：

山大辰星实验室做法：取到样品后，一部分送去测宏基因组，一部分用于涂布计数筛选，还有一部分用于富集培养。

在涂布计数方面，选用不同的培养基（普通细菌专用，放线菌专用，弧菌专用，ect），不同的培养条件，尽可能统计出所有的细菌数目。然后进行挑选，只要是外表不一样的都挑出来进行纯化测序，确定其分类地位。富集培养部分，由于富集培养会大大降低原有优势菌群的数量，使一些细菌群落中的劣势菌株得以生长，然后再把富集培养后的成分在不同的时间点测宏基因组，涂布计数，再重复初步分离的工作。最后将宏基因组数据和鉴定的可培养细菌的数目进行比对分析。

学习交流助升华，思想碰撞出火花！楼主Watson参考了大家的建议，最后自己总结了解决的方法，并表示欢迎各位继续批评指正~

Watson微生物研究难点：人工难分离培养~！  所以现在有了宏基因组。但宏基因组等只是预测，后续研究思路才是重点。这里列出四点：

1）分类学研究，即预测后的人工分离培养。用于确定环境微生物的确切信息。尽量多的培养提取微生物，从而验证环境微生物预测，完成试验猜想。具体培养方法就如同山大辰星所说，用不同优势培养基培养、扩繁、提取、测序。2）多组学验证预测。就是从不同层面的再次预测。方法就选用二代、三代测序，从蛋白、甲基化（只是举个栗子，可考虑形态学、代谢组、转录组等不同层面。），等等再次预测，以达到相互印证。3）基于方法a的后续进行形态学、代谢组学等研究。不测序，直接在培养扩繁过程中研究形态学、代谢等……4）meta分析。个人想到的一个方法，这个meta分析是需要结合研究课题的目的，从试验问题出发，通过已有的大量测序数据（同行或类似结果），从统计学角度对自己试验结果可靠性的一个评估。从而再回归到本研究目的，一定程度上解决自己的试验问题。meta分析需依据相似环境的结果，这个只是个想法，可能不太成熟，希望各位补充。

想要查看网友们的回答，或者想跟楼主Watson探讨自己的想法，可以戳下方的“阅读原文”，马上跳转到论坛贴~ 嗯，今天就到这~

★



★

    关注 基迪奥生物