观点丨CRISPR引发小鼠体内基因突变属于过度解读？

CRISPR到底是否会带来意想不到的副作用？有人认为CRISPR作为本世纪最伟大的技术之一，其缺陷被人为忽视了；而也有人认为论文中提到的实验用小鼠并不是好的研究对象，其得出的数据是片面的。为此，DT君专门采访了上海科技大学的副教授刘佳博士...





2017 年 5 月 30 日，《自然·方法》（Nature Methods）刊登了一篇文章。来自哥伦比亚大学等机构的研究人员发现，在治愈小鼠相关疾病遗传性疾病的同时，基因编辑常用的工具 CRISPR/Cas9 可能会造成很多意料之外的基因突变。

文章刊登后引发了十分广泛的关注。一方面，CRISPR/Cas9 作为最有效的基因编辑工具之一，已经广泛应用到各类研究中。另一方面，中国已经开始利用该基因编辑技术的临床试验。



图丨相关研究报告已于5月30日发表在《自然·方法》官方网站上

CRISPR 到底是否会带来意想不到的副作用？有人认为，CRISPR 作为本世纪最伟大的技术之一，其缺陷被人为忽视了。而也有人认为，论文中提到的实验用小鼠并不是好的研究对象，其得出的数据是片面的，缺乏可靠性。

为此，DT君专门采访了上海科技大学研究副教授刘佳博士。刘佳博士的研究方向为用基因编辑技术的改进和应用。以下是经过整理后的采访内容：

问：这篇论文是以什么形式发表的？

刘佳：这篇文章是以 correspondence 的形式发表在《自然·方法》（Nature Methods）上，correspondence 这种形式可以翻译成研究者投稿。与其他类型的文章（Brief Communications 或 Articles）相比，correspondence 不强调研究的系统性，而强调时效性，有时候不够全面。

《自然·方法》设置这个栏目的宗旨就是能及时分享给大家有用的信息，哪怕相关信息不够全面。

问：目前有学者批评这篇文章有对照组设置不全等缺陷，请问您如何评论？

研究性质的 correspondence 仍然需要同行评议，而且《自然·方法》也是高水平的杂志，所以数据可靠性和学术上的价值很可能还是可靠的。

问：这篇文章到底说了什么？

刘佳：这篇论文非常简洁，如果翻译出来篇幅也不长。文章内容在第一段已经把主题说得很清楚，就是大家之前在分析 CRISPR/Cas9 的脱靶效应的时候，考虑的可能不是那么全面，需要更加重视全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）的作用。

基因编辑中出现的脱靶包括不同的形式，例如单核苷酸差异（single-nucleotide variants，SNVs），以及核苷酸的插入与缺失（insertionsand deletions, indels）。

从技术上来说，文章通过显微注射技术将 Cas9 核酸酶蛋白质、单链寡聚脱氧核苷酸（single-stranded oligodeoxynucleotides, ssODN）模板注射到小鼠的受精卵（zygotes），建立起杂合的亲代小鼠。研究者采用全基因组测序（WGS）分析了由亲代小鼠繁殖出的子代小鼠的突变情况。

通过和对照（未经过基因编辑）小鼠比较，基因编辑小鼠出现了更多“脱靶”的Indels和SNVs。同时，这些 SNVs “脱靶”位点和设计的 sgRNA 具有较低的同源性，因而很难被传统的方法预测到。



之前的研究中，大家常常用全外显子测序的方法检验 CRISPR/Cas9 是否影响了基因组的其他位置。从某种意义上来说，全外显子测序只检查编码蛋白的部分。另外，虽然也有科学家使用WGS检测动物上的“脱靶”效应（例如文章中所引用的参考文献3），但传统检测手段更关注于 “脱靶”效应引起的核苷酸插入与缺失（indels），而不是单核酸突变（SNVs）。

而在这篇文章中，作者表示，他们使用了全基因组测序的方法后，发现了一些以前没有发现的脱靶效应。所以，这篇文章受到了不小的关注。

问：为什么此前的全基因组测序没有发现这些新产生的脱靶效应？

刘佳：虽然此前研究人员的确使用全基因组测序研究过脱靶效应，但是使用频率不如全外显子测序高。全外显子测序某种意义上可以理解为只检测编码蛋白质的序列。

这是因为全外显子测序的成本比较低，在基因编辑技术刚出现的 2014 年，国内实验室要做一个全基因组测序可能需要几万元。如果一个实验室需要样本，设置不同的组，再重复几次，可能一个实验室一年的经费就没有了。

这两年，全基因组测序的成本降下来了，然后大家又对安全性格外关注，所以才会更多地考虑用全基因组测序来对编码区和非编码区同时进行测序，以此检测基因编辑的副作用。

问：这篇文章确实提到了基因编辑技术会导致一些意想不到的突变，是否会影响之前的利用相关技术研究的可靠性，提升临床试验的风险？

刘佳：从科学的严谨角度来考虑，每个研究都需要在严格界定条件的情况下才能获得有意义的结论。在基因编辑领域也是如此。实际上已经有很多实验证实，细胞类型、Cas9核酸剂量、sqRNA设计等条件会对脱靶效应等基因编辑的结果造成非常大的影响。

 

这项研究使用的是小鼠受精卵，通过显微注射将 Cas9 等相关元件注射到细胞中。同时，文章通过全基因组测序分析了 indels 和SNVs。无论是实验条件还是分析方法都和此前研究有很显著差别，不能直接用来比较。

此外，这个文章作为一篇correspondence也不是（或者不需要）很系统，它只是给大家这么一个信息，实验完整性相对此前的很多研究还是有一定差距。

一个研究能进入临床试验，说明前期相关研究人员的工作非常系统。在中国现有法律的规定下，如果要通过临床试验的审批流程，研究数据要非常扎实，在研究系统性上往往要远远超过一篇高水平的文章能提供的信息。

如果你看一下这篇论文，会发现作者在遣词造句的时候非常谨慎小心，只是希望让大家意识到全基因组测序的重要性，除此之外没有多余的评论，更没有认为这篇文章会对相关的临床试验有任何指导意义。

医疗技术能进入临床，说明无论是从医院的角度、国家的角度，还是实验室自己信心的角度来说，都已经看到了非常确凿的依据。系统性、具有生物相关性的研究，将对今后的临床实验更具有指导意义。



图丨哥伦比亚大学研究团队的实验结果数据比对

问：这篇文章会对行业产生什么样的影响？

刘佳：这篇文章主要讨论的是基因编辑的检测方法，证实了通过全基因组测序可以揭示出非预期的“脱靶”效应，特别是单核苷酸突变。但是对 Cas9 的好坏，以及基因编辑本身的安全性等问题没有进行讨论。文章主要希望表达的内容是，全基因组测序这一之前不是很常用的方法，可以更全面地分析 CRISPR/Cas9 地脱靶效果。

此项研究给行业带来的最大变化是，科研人员在对 Cas9 基因编辑结果分析时将更多地考虑全基因组测序，并分析除了核苷酸插入与缺失之外的单核苷酸突变。

对科学界来说，这篇文章报道了一个案例，不能否定整个行业。Cas9 作为一个强大的工具，在很多地方都有不同层面的证据支持它的有效性，换句话说，它已经有系统性的证据进行支持。而反观这篇文章，本身并不是系统性的工作，只是举出了一个观测案例。作者也没有试图质疑整个领域。

事实上，CRISPR/Cas9技术从 2012 年出现到现在，已经出现过很多次类似的“危机”，如“脱靶”效应等。但是，每次“危机”都伴随着技术的改进与提升。

总之，这篇文章对基因编辑结果的检测手段提出了讨论，对整个基因编辑领域的健康发展很有好处，对整个行业起到了非常积极的推动作用。研究没有否定基因编辑行业的之前的工作，只是提升了行业标准。

Cas9 从 2012 年才开始得到应用，现在生物领域只要做生物医药的基本都会使用这一工具。短短 5 年时间就发展成现在这样的规模，非常罕见。正是因为如此，Cas9检测方法的提升可以让整个生物医学领域都受益。

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