假做真时俱是真：漫谈奇妙的骨打印技术

“他用笔画了一只鸟，鸟扑扑翅膀，飞到天上去，对他喊喊喳喳地唱起歌来。”——《神笔马良》...





 “他用笔画了一只鸟，鸟扑扑翅膀，飞到天上去，对他喊喊喳喳地唱起歌来。”——《神笔马良》

骨科医生马良是个勤劳、刻苦、有志气的年轻人。他每天勤练骨折治疗本领，学会装钢板、学会打钉子，晚上，他捧着书本，回忆白天手术中见到的那些粉碎性骨折和骨质缺损。

有一天，他得到了一支神笔。他用这支神笔画肌肉，肌肉就强劲地收缩；画关节，关节就动了起来。这事被病人们知道了，要马良给他们画骨骼。马良画了一堆骨小梁，又在骨小梁上画了许许多多的细胞，又画了许多血管和细胞因子......它们全都活了起来，一眨眼就把病人的骨缺损填平了。从此，马良用自己的本领自由自在地为骨缺损的患者们画画，画出他们所需要的骨头......



亲爱的读者们，如果有朝一日，《神笔马良》的故事是这样书写的话，你会不会觉得意外呢？如果有人告诉你：你也可以成为马良，画出、或者是用打印机打出活生生的人体器官来，你是否又会感到不可思议呢？也许，这一天已经来到了。

在过去的十多年里，我们的科学家们已经开始用组织工程学的手段，在实验室里培养制造人体器官（例如耳朵），而今天我们要去探索的，则是骨骼领域的组织再造，而且是用打印机直接打出来，想想就很令人兴奋吧？

自骨外科手术时代开启一百年以来，骨缺损就一直是个困扰医学界的大难题。迄今为止，人类使用的自体移植骨、异体移植骨、异种骨都不能满足广泛的、复杂情况下的治疗需要，且这样那样的各种植骨并发症令人烦恼（具体的内容Blabla，你可以在任何一部骨科典籍或相关文献上找到）。90年代以来的骨组织工程学（Bone Tissue Engineering，BTE）则为骨缺损修复提供了长期希望。一个完整的BTE是由四个不可或缺的要素构成的：1）多能分化的干细胞，能够在体内外发展为成骨细胞，继而生成骨细胞；2）干细胞发育生长的骨架、通常是具备生物活性、模拟人体微孔结构的的无机或有机材料；3）促进分化、成骨和骨组织成熟的各种细胞因子，例如大家再熟悉不过的BMP；4）新骨发育和修复过程中所必需的血液循环。除了具备以上四个因素外，还有一个最关键、也是最难的问题，是实现以上各个要素的整合，真正建构出一个组织工程骨出来。



骨组织工程学（BTE）的基本思路：干细胞+支架材料+构建说实话，这真的是一个庞大而复杂的工程。单单一个干细胞、或者生物材料领域的研究，就已经够全世界无数研究人员穷经皓首一辈子的了。十年前我读博士研究生的时候，做的课题就是上述要素2——也就是生物支架材料领域的，那时候雄心勃勃，还梦想着一口气把新型生物材料和细胞因子控释技术结合起来，现在看来真是不自量力！这么多年过去了，即便是在生物材料和细胞因子领域，我们在临床实际应用上看的进展，依然是只能用“慢慢吞吞”来形容。

骨组织工程学这么好的东西，却在临床应用方面进展如此迟缓的原因，最主要的就两个：一是复杂而慢；二是不经济。试想，传统的工业化时代所赋予人们的思路就是：一个治疗（或者产品）你需要把它分为若干个工序，而每一个工序的成品你又必须实现一定的产量，否则就会亏损到没有人敢参与。很显然这种思路在组织工程学骨修复治疗上是行不通的。骨缺损的修复不容许有漫长时间的等待（旷日持久的实验室制备、合成、培养，也会让治疗的经济代价高得不切实际），更需要有个性化的方案。

2009年有位俄罗斯科学家Mironov在骨科领域提出了一个“生物复制（Bio-fabrication）”的概念，并付诸于实施，准确的说，他用当时还很新潮的3D打印技术，把骨组织直接打印出来。“骨打印”这个想法其实最早是90年代末组织工程学人员在痛苦的细胞、支架分步培养操作中冒出的大胆设想。1999年的时候，有人脑洞大开，用市面上的HP或者EPSON喷墨打印机，把脊髓细胞“打”到了玻璃板上的培养基表面，通俗地讲，就是在这里滴几个细胞、那里滴几个细胞而已。人们突然发现，这是个好主意，至少在速度、分布和效率上，比起以往的手工种植细胞要强多了。于是这帮人不怕事大，进而开始用打印机“打”蛋白质分子和大细胞悬浮液（我们前面说过的成骨细胞因子，就是一些蛋白子大分子；而干细胞有的体积很大）。为了实现这一点，研究者突然发现需要把HP打印机和EPSON打印机的喷墨口弄得大一点，因为原先的喷嘴口径过于精微（汗）。通过这种打印方法获得的细胞，大约能够存活75%左右。到了2004年，科研人员们已经能够通过改良的喷嘴来打印软骨细胞、成骨细胞和成纤维细胞这些组织工程学最常用的细胞了。



二维的细胞（悬浮液）打印

也就在1999~2004年这段时间里，3D打印开始被用于细胞支架材料的打印，这可是个革命性的进步，骨组织工程学治疗所需的生物支架材料可以不受批量生产的限制，随时打印随时取用了。当时用3D打印方式制备的生物支架材料，通常是多孔有机聚合物，用的是激光烧结、融熔沉积等方法。它们的共性是通过热力或者光聚能量，将单体物质“烧固”成新的支架结构。但这类方式——很显而易见地——不适合用作细胞物质的打印，原因是打印过程中的高压、高温和单体物质的毒性。

激光烧结（Laser Sintering）的3D打印法：通过单体粉末的逐层烧结，一层层地“堆”出3D结构。



融熔沉积（Fused Deposition Modelling）的3D打印法：将烧融的材料基质，用逐层编织的方式，一层层“堆”出3D结构。那么，是否可以用3D打印的方式，直接将细胞、蛋白分子和支架材料一股脑儿地直接打印出一个立体结构来呢？让我们回过头来说说那位Mironov先生，他认为这是可行的。他首先用计算机模拟出一个骨缺损部位的立体形态，然后进行3D的细胞、支架、成骨因子“一揽子”打印，然后再在培养箱里进行短时间的“孵育”，然后就可以把这个完全个性化的、同时具备人体新生骨骼一切必备要素的3D打印骨，移植在患者身上。Mironov把这个称之为“生物复制（Bio-fabrication）”，他把主要精力放在了打印体的无菌性、支架材料的细胞相容性、降解速度和多孔立体性、以及打印液的快速成型性这几个问题上面，同时确保筛选出的方法，能够在打印骨植入体内后能够实现快速的血管长入和人体矿物质沉积。



率先实现3D打印骨的俄罗斯Mironov团队，左四的大胡子是Mironov教授。

在Mironov的启发下，欧洲、美国的多支研究团队开发出了符合上述理念的3D打印骨制造技术。其中具有代表性的有“光固化成型”（或称“立体光雕”）技术。方法是，将细胞、蛋白质分子培养在一个基质溶液池子里，然后将激光束或紫外线射入这锅“细胞汤”，池子里的基质液体是光敏感性的，受照射后就快速凝固，通过控制光照的方向可以制造出3维形状的固体出来。这就好比是在家里自制布丁，所不同的是，用这种方法做出来的，是一个布丁液中的特殊形状布丁。立体光雕法的好处在于成型快速，但是缺点是每一层固化体之间的细胞流动和沟通不太通畅。



“光固化成型”（或称“立体光雕”）技术（Stereolithography）：把激光束射进液态的单体物质池中，使得受照射得光敏单体物质发生聚合固化，有目的地制造出3D结构。

还有一种方法叫“生物墨水”(Bio-ink)技术，这个有点像我们上文提到过的2D细胞打印的立体叠加，所用到的就是普通打印机那样的简易设备，不但廉价、安全、而且高度自动化。用这种方式打印出来的3D骨还具有很好的微孔性能，便于细胞的移动和增殖。缺点就是无法打那些体型较大的干细胞，没办法，还是喷嘴的缘故。



生物3D骨打印机

此外还有Bio-Plotting等简单易行的注射打印技术。可以说，骨打印会变得越来越方便、越来越快速，在3D打印一次性构建新生骨的同时，科学家们还通过基质（支架）材料不断优化、微孔性能不断改良的努力，使得这种3D打印出来的骨组织，在植入体内后，能够快速吸引新生血管的长入、钙磷等矿物质的沉淀、以及血液中各种细胞因子的汇聚，使得3D打印骨在最短的时间里变得坚固、与人体自身的骨骼融为一体。3D打印的骨组织不仅为临床上大量的骨缺损患者带来了经济、高效、个性化的福音，还能够被用于药物试验、以及各种少见的骨疾病的研究，大大地改变我们的世界。



未来的3D打印骨，一定是在各项性能上与人体骨骼（或软骨）并无二致，并且能够随时打印、随时植入的，其方便程度，也许技术人员只需像今天的打字员那样，轻描淡写地问医生：“您是要喷墨的，还是要激光打印？”

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