qPCR实验金标准--MIQE

本节公开课要点1.MIQE标准的定义和目的2.MIQE标准的内容样本采集和处理方面的要求核酸提取的要求和...

本节公开课要点

1. MIQE标准的定义和目的

2. MIQE标准的内容

样本采集和处理方面的要求
核酸提取的要求和质量控制
RT反应的要求
qPCR过程的要求
数据分析的要求

MIQE（MinimumInformation for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）是国际上推出的一套荧光定量实验指南，就评价荧光定量PCR实验和发表文章时所必需的实验信息提出了最低限度的标准。通过实验者提供的实验条件和分析方法，评阅人员可以更好的评估研究者实验方案的有效性。同时，MIQE标准要求研究者充分展示所用的试剂、扩增的序列和数据分析方法，以保证其他研究者能够重现实验结果。

核酸提取是荧光定量PCR实验的前提，核酸的质量决定了后续的反转录获得的cDNA的质量及荧光定量PCR分析的准确性。因此，在提取核酸后需要对核酸的质量进行监控，在MIQE中，在核酸提取层面的要求包括核酸的定量分析、完整性分析及核酸的纯度分析。

核酸的定量分析就是检测提取核酸的浓度，以保证不同样本间核酸量的均一性和后续反转录及定量实验时不同样本间的条件统一，从而保证了定量实验结果能够准确反映样本间的待测基因差异。

核酸的完整性分析，就是确保核酸的完整、未被降解。尤其对于RNA来说，在体内的降解非常明显，这是mRNA为应对环境刺激而进行的自然调节，即使高质量的mRNA样品也显示出不同程度的降解。因此，MIQE标准要求实验者至少需要提供总RNA电泳检测结果，如果可以，最好提供RNA的微流控分析结果或参考基因或靶基因的3’和5’的完整度检测结果。

核酸的纯度分析，就是确保核酸样本中不含有其他大分子或离子杂质，其中包括核酸有机物（如酚类或醇类、蛋白、其他种类核酸等）的污染。实验者往往在核酸提取后测定OD260/OD280检测核酸的纯度，然而这种方法并不能检测出基因组DNA的污染情况。在MIQE文件中特别强调了RNA样本中基因组DNA的污染，因为基因组DNA污染会严重影响最终的定量结果（图1）。分析RNA中基因组的污染情况至关重要，在荧光定量PCR实验中我们建议除设定常规的NTC（不包含模板的对照）外，还需设定NRT（不进行反转录的RNA对照），从而分析RNA模板中是否包含基因组DNA的污染。实验者应检测和报告基因组DNA的污染程度并记录能够耐受的这些污染的临界值标准。另外还应重点报告RNA样品是否已经过DNase处理（包括酶的类型及反应条件），并报告每个核酸样本在阳性对照组和NRT对照组下Ct值的比较结果。

图1.基因组DNA会对定量造成严重影响。图中四个样本的模板均来自于同一样本RNA，其中NRT with gDNA为未经DNase处理带有基因组DNA污染RNA样本；RT with gDNA为未经DNase处理带有基因组DNA污染，反转录后的cDNA样本；NRT without gDNA为经过DNase处理不含有基因组DNA污染的RNA样本；RT without gDNA为经过DNase处理，反转录后的cDNA样本。四个样本的Ct值不同，其中RT without gDNA组真正反应了样本中待测基因的表达量，而NRTwith gDNA和RTwith gDNA的Ct值低于RT without gDNA样本，尤其是前者，理论上说无cDNA存在，不应产生扩增曲线（如NRT without gDNA组）。这就说明，不经过DNase处理的提取容易产生以基因组DNA为模板进行的扩增，严重影响定量结果。

对于基因组DNA的去除，常规方法常常使用DNase处理RNA的方法，但这种方法往往耗时较长，RNA损耗较大，并容易引入RNase污染。TIANGEN FastQuant RT Kit (With gDNase)(目录号KR106)能够在反转录前进行3 min的去基因组处理，整个反应只需21 min即可完成，使得整个反转录过程更加快捷、简便，并最大限度的减少了操作过程中的RNase污染及RNA的损耗（图2）。