一张图，掌握Western Blot中的化学发光法！

欢迎您关注“ BioEngX 生化工程实验室 ”微信公众平台！...





化学发光法（chemiluminescence），顾名思义，就是利用化学反应来产生光，现在被广泛应用于Western Blot的检测中。那么今天小编就“看图说话”，给大家仔细讲一讲化学发光法的原理。

在常用的间接检测中，一抗（primary antibody）会和抗原决定基（epitope）结合，经过辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记的二抗 （secondary antibody）会和一抗结合。随后，转渍膜（membrane）会在化学发光剂的底物混合物中温育。在过氧化氢 （peroxide, H2O2）的作用下，HRP会把化学发光底物氧化降解，同时反应的另一个产物就是波长为425nm的光。底物通常包括luminol, isoluminal以及它们的衍生物。而其中最常用的就是luminol。在增强剂（enhancer）的帮助下，发光信号被增大至少1000倍，甚至能检测到飞克量的抗原。

根据不同的底物和增强物的配方，发光反应的半衰期从几分钟到几个小时不等。因为有了增强剂，信号的敏感度、强度和持续时间都被提高，这才使得X光胶片（放射自显影片）感光或电子照相成像等方式得以应用。大家可以将转渍膜反复在胶片上曝光来找到最佳的结果。当然，正如之前几篇文章提到的，大家也可以先将膜上的免疫检测试剂进行剥离并重新检测。

介绍了原理之后，小编再给大家介绍一下X光胶片具体的成像操作。在暗室成像已经是很传统的方法了，而电子成像技术越来越普遍。但是根据个人经验，胶片的敏感度还是要比电子设备高的。

1. 转渍膜制备

• 常规方法完成SDS-PAGE；
• 使用合适的封闭液；
• 电转膜；
• 可以通过标记一抗（直接）或二抗（间接）的手段引入HRP；
• 中间的淋洗不要遗忘，淋洗越久，背景就会越低。在与HRP交联物温育后，膜片更需要仔细洗涤；
• 所有步骤都可以在室温下完成。封闭和一抗温育也可以在4度进行。

2. 化学发光试剂的配置

• 在使用前等量混合A液和B液，混合后要尽快使用，每次现配。
• 将膜片置混合液中于室温下振荡温育2到5分钟，每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml来覆盖全膜片。

3. 蛋白信号显现

• 用平头镊钳住膜片，垂直置于吸水纸来去除过量化学发光试剂；
• 将膜片放在两层塑料膜之间，吸走多余试剂，并且赶尽气泡；
• 吸附蛋白面朝上，放在X光片盒中；
• 在暗室里压上X光片；
• 根据信号的强弱适当调整曝光时间。第一张片子建议大家曝光1分钟，观察结果后判断最佳曝光时间可从30秒至2小时不等。找到最佳效果后，显影冲洗。

BioEngX

“BioEngX”活跃在移动端的无国界学术圈 持续推送生化工程领域科普文章、科研动态、实验技术及海外名校本科研究生课程安排、博士/博士后职位信息等。长按二维码，轻松关注。

    关注 BioEngX生化工程实验室