Km, Kcat 傻傻分不清楚?_【BioEngX生化工程实验室】

研究酶的科研汪们都知道，无论是表达一种新酶，还是工程一个现有的酶，都需要对酶的一系列特性进行表征。小编上期已...

研究酶的科研汪们都知道，无论是表达一种新酶，还是工程一个现有的酶，都需要对酶的一系列特性进行表征。小编上期已经介绍了酶的一些性质，点这里。后面小编会带大家逐渐了解如何测定酶的各种性质，不过小编毕竟水平有限，如有不当之处还请大家留言指正。

这次，我们主要说说Km和Kcat。Km、 Kcat、Vmax之间到底啥关系？我们先来看一张图。

上图的横坐标是底物浓度，纵坐标是酶的反应速率。这个就是酶促反应动力学曲线了，可以用米氏方程来表征：V = Vmax[S] / ( KM + [S]), 也可以写成V = Kcat[E]t[S] / ( KM + [S]), 公式中的V指反应速率，[S]是底物浓度，[E]t是酶的浓度，Km是一个常数，Kcat也是一个常数。这两个常数的意义我们后面再说。图中还有一个Vmax，这是最大反应速率，Vmax=Kcat[E]t.

从这个曲线我们可以知道，在底物浓度很低时，酶的反应速率会随着底物浓度的增加迅速增加。此时酶的活性位点的是空的，等着底物来结合，所以产物形成的速度由可利用的底物浓度决定。当底物的浓度增加时，酶的活性位点渐渐被底物饱和，此时底物形成的速率由酶的浓度决定，当活性位点被底物饱和以后，添加再多的底物都不会对酶促反应速率产生影响，此时达到最大酶促反应速率Vmax。下面我们说Km和Kcat这两个常数：

Km（Michaelis constant，米氏常数）

Km是米氏常数（Michaelis constant），其实全称是米歇利斯常数，可能米歇利斯太难记了吧，所以大家都简称为米氏常数（为啥你们可以记住阿基米德原理，拉格朗日方程？小米同学应该会有点桑心）。米氏常数衡量的是酶与底物之间亲和力（affinity）的大小（这里指遵循米氏方程的酶）。Km等于酶促反应为最大反应速率一半时的底物浓度，其单位是mol/L，因此Km越小，表明酶进行反应所需的底物浓度越低，也可以说酶与底物之间亲和力越大。Km是一个常数，当pH，温度，离子强度不变时，Km是恒定的。

Km的重要性

Km是非常重要的参数，在酶的应用过程中，底物浓度选择常常需要参考酶Km。

1. 测定酶的活性

为了测定一个酶的活性，底物浓度应该怎么选择呢？我们通常是利用产物生成速率来衡量酶活性，在温度，pH等条件不变的情况下，产物的生成速率受到酶的活性，底物浓度的影响。我们为了测定酶的活性，自然应该使酶的活性本身作为唯一的变量，这就意味着底物的浓度必须非常高，使酶的活性位点饱和，确保酶催反应速率达到最大值Vmax。在实践中，底物的浓度常需要高出Km值的10-20倍。

2. 测定样品中底物的浓度

我们有时候会利用酶来测定其底物的浓度，比如利用荧光素酶测定ATP的浓度从而来测定细菌的数量（每个细菌内ATP数量是固定的，ATP越多说明细菌越多）。此时，我们需要保证底物的浓度是唯一的限制因素，底物的浓度必须要低于Km值，这样产物的生成速率会随着底物浓度的增加迅速提高，这就提高了检测底物的灵敏度。

Kcat

又叫转化数（turnover number），利用Vmax除以酶浓度进行计算。所以可以知道，Kcat衡量的是在最有优条件下酶催化生成底物的速率。为什么说是最优条件呢？因为此时反应速率最大（Vmax），酶的活性位点已经被底物完全饱和。Kcat是一个常数，其单位是1/s，也可以将Kcat理解成单个酶分子在一秒内转化底物的数量，或者单个酶分子转换一个底物分子所需的时间，因此Kcat也叫做转化数。

Kcat/Km

两个常数的比，当然也是一个常数。Kcat与Km的比是衡量一个酶催化效率的最重要参数。Kcat越大，Km越小，二者的比值越大。Kcat越大说明酶转化底物的速率越快，Km越小说明酶与底物之间亲和力越大。当酶有多个可利用的底物时，其对不同底物的催化效率可能差别很大。Kcat/Km就可以用来确定酶的最适底物，同一个酶对不同底物的Kcat/Km最大可相差100万倍。当利用蛋白质工程对酶进行改造时，不同突变型的Kcat/Km也是需要要测定的参数，用来表征酶催化效率的变化情况。

呀！不知不觉写了这么多。Km，Kcat这么重要，应该怎么测量呢？等待小编的下篇文章吧。如果你对酶感兴趣，请扫描下方二维码加入BioEngX-生物催化剂科研分享群。

更多精彩内容，点击阅读原文，访问我们的官网：http://www.bioengx.com

历史文章

点击下列链接，浏览历史好评文章~~

全看懂证明你是猴子请来的生物学霸！
纳尼！啤酒与生物工艺也能扯上关系？一篇文章让你彻底读懂啤酒！
同样都是动物，为啥会有红肉和白肉之分？
减肥，我们是专业的！
卖肾换iphone"时代"或将被终结！这到底是为什么？
世界首例婴儿白血病患者被成功治愈!
号外号外：濒于死亡线上的癌症晚期患者将有望被治愈
癌症为何难以根治？
等你老了，估计可以少担心一种疾病的发生了~
晒被子后的“太阳味”是螨虫被烤死的味道？
喝酒脸红的人, 酒量到底能不能练出来

做PCR 时降低污染的小方法
培养大肠用什么培养基？只知道LB你就out了
提取质粒DNA和基因组DNA的区别
DNA沉降-乙醇vs异丙醇
细说小分子短肽标签（一）之His-Tag
Western Blot 常见问题和处理方法
一张图，掌握Western Blot中的化学发光法！
DNA电泳常见问题与对策
分子生物学实验室内常见有毒物质及防护措施
提纯你的DNA样本，很急、很关键！
关于Bradford Assay, 你可能不知道的事
利用Photoshop为免疫印迹做图技巧
你知道为什么DNA 比RNA 稳定吗？
DNA 测序技术的发展：第三代测序法
浅谈ELISA的那些事儿

BioEngX是一个生化领域人才深度交流的平台：你可以在这里分享实验技术与经验，表达自己的科研领悟与想法；你同样可以在这里向大众普及生化知识或是解释科学现象。这虽然是一个快节奏的时代，微博大行其道，但思想的交流与碰撞绝不是140个字所能承付起的。因此每一个作者将在我们网站中拥有一个博客账户。如果你有发声的愿望，乐于表达与分享，欢迎加入我们。扫描二维码，加入到BioEngX Writer Pool，分享你的知识，传播你的能量。