SKY·学术 挑战班同学热议细胞自噬领域研究 ——记2017/3/25挑战班JC

四位同学为同学们带来了一场以“Autophagy”为主题的精彩文献讨论盛宴，嘉宾老师是中科院动物研究所干细胞与生殖生物学国家重点实验室研究员李卫与北京生命科学研究所高级研究员杜立林。...

2017年3月25日，一个乍暖还寒的明媚春日。在洒满阳光的静园草坪旁的四合小院中，夏宁静、魏铮、焦中罡和王闽铭四位同学为同学们带来了一场以“Autophagy”为主题的精彩文献讨论盛宴。嘉宾老师是中科院动物研究所干细胞与生殖生物学国家重点实验室研究员李卫与北京生命科学研究所高级研究员杜立林。此次JC由班主任杨竞老师指导。日本科学家Yoshinori Ohsumi凭借其对Autophagy分子层面理解的工作独享2016年诺贝尔生理学奖。Autophagy究竟是什么？它的作用机理有哪些？研究它对于我们理解复杂生命现象有哪些意义？对其研究成果是否有临床的应用价值？同学们带着这些疑惑走入了静园1号院104房间。

其实，早在半个世纪以前Ohsumi还在东京大学做本科生时，autophagy概念就已被提出。在1963年关于溶酶体的Ciba Foundation Symposium上，凭对lysosome和peroxisome开创性研究获得1974年诺贝尔奖的洛克菲勒大学泰斗de Duve提出了“autophagy”、“autophagosomes”等名词描述被运往溶酶体的单层膜／双层膜的小泡。

在此后的30年间，通过morphology层次的研究，人们对细胞自噬现象取得了不少的进展，例如可以在大鼠的肝细胞中观测到饥饿时自噬现象加剧。其背后的机制是什么呢？细胞实验的结果显示，胰高血糖素能够促进细胞自噬，而胰岛素可以抑制细胞自噬。1982年挪威的Seglen一篇PNAS文章还通过生化分析找到了可以抑制autophagy的3-methylademines。但是，引发细胞自噬的分子机理却在对哺乳动物细胞的陷入了僵局。

打破这一困境的正是Ohsumi：他利用酵母作为研究体系，通过正向遗传学的方法筛选出了一系列autophagy-deficient的酵母（pep4缺陷：众多水解酶上游的调控开关），进而确定了一系列Autophagy-related （Atg）蛋白，进而将其中的信号通路几乎一网打尽。其中比较重要的工作包括1992年的JCB，从morphology观测yeast的autophagy与mammal相近（Dr Du’s comments：彼时Ohsumi研究重点是vaculoe，选用了极端的诱导条件幸运地观测到了细胞自噬现象）；1993FEBS，第一次通过遗传筛选的策略寻找相关基因；1997年的Gene，找到了第一个Atg——Atg1。[1]（Dr. Du’s comment：当前领域内最大的问题是无法确认complex machinery的机理，遗传学家需要生化和结构领域专家的协助。）

[1] 饥饿引发细胞自噬，是否会有选择性地吞噬细胞器呢？de Duve电镜观测的结果在抑制蛋白酶活性条件下在autophagosome中积累了许多线粒体。（不同的诱导条件会激发不同的自噬通路）

1995年荷兰阿姆斯特丹大学的Meijer JBC工作显示Rapamycin能通过抑制ribosomal protein S6的磷酸化促进大鼠肝细胞的细胞自噬（Ohsumi1998在酵母体系中也证明了这一点）。

细胞自噬机理的阐明对于我们理解疾病有哪些帮助呢？首先是癌症。1999年哥伦比亚大学的Beth Levine一篇Nature Letter第一次报道肿瘤抑制物Beclin1在细胞自噬通路中也发挥着重要的作用。此外，细胞自噬清除异常的蛋白功能如果出现了问题，哪些功能不全、错误折叠的蛋白就有可能在体内堆积，这与奥兹海默症、帕金森症、亨廷顿症的病理特征十分相似。细胞自噬异常与神经退行性疾病的关系相关工作最早由Rubinsztein实验室作出。

此外，细胞自噬与衰老和长寿的关系也是研究的热点。目前唯一确认可以延缓衰老的手段是控制热量的摄入。有趣的是，根据比萨大学Bergamini团队的研究，卡路里限制能够保持细胞自噬的活力（正常情况下，随着个体的衰老，细胞自噬活力下降，由此还会引起免疫系统的衰退）。之前提到的Beth Levine于2003年发表于Science的工作报道，Bec-1敲除会降低长寿型线虫的平均寿命。

在引论部分的结尾，夏宁静同学提出了这个领域比较重要的一些问题：macroautophagy过程中的膜是如何形成的？细胞自噬的高度选择性是如何实现的？Atg蛋白行使功能的具体机理是什么？另外细胞自噬的上调和下调在不同背景下的生理意义怎样？

之后，焦中罡和王闽铭两位同学分别对2015年Nature上的三篇细胞自噬的文章向同学们进行了介绍：

（一）在自消化线粒体的过程中，泛素激酶PINK能将autophagy receptor募集到待吞噬的线粒体上（2015.8）本文是NIH的Richard Youle的新作。Youle对细胞自噬控制线粒体的问题有相当长的一段历史了。他在2008、2010年PLOS和JCB的工作已经发现当线粒体受到损害，膜电势出现异常时，PINK会被募集到线粒体膜上，进而对ubiquitin ligase的Ser65进行磷酸化，促发细胞自噬。他2008年JCB上《Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy》第一次回答了“parkin是如何影响线粒体自噬”这一问题，至今被引量已超过1800次。

Parkin这个名字不禁让人联想到Parkinson Disease，它们之间是否存在联系呢？这一切可以从1998年日本科学家Shimizu 的Nature文章找到答案。在这篇文章中，Shimizu通过基因定位的方法找到了常染色体隐形青少年帕金森病的突变位点，并将其编码的蛋白命名为Parkin。后来人们才发现这一蛋白具有ubiquitin ligase的功能。

本文另一位通讯作者Adam Fogel本科期间就在Brandeis Dr Li Deng实验室做科研，在耶鲁接受PhD训练，在NIH Youle实验室从事博士后工作，现在在由Duke大学Michael Ehlers担任EVP（executive vice president, Research and Development）的Biogen公司任职。

在细胞自噬处理异常线粒体（即mitophagy）领域最重要的问题是什么？首要问题无疑是理解PINK如何将有问题的线粒体作出“标记”，使得其被泛素化进入细胞自噬程序。本文的目的也是想找到PINK／parkin介导的mitophagy通路中特异的一些autophagy receptor。

为了实现这个目的，Youle首先将五个潜在的autophagy receptors在内源不表达Parkin的Hela细胞中同时敲除（Fig1aWestern Blot是对KO的validation），然后观察KO对在Oligomycin／Antimycin A诱导线粒体损伤后mitophagy的影响。[2]如何判断mitophagy的程度呢？本文主要有两个评判指标：COXII 含量和mtDNA含量。COXII是由线粒体DNA表达在线粒体内膜上的蛋白，对于WT来说，加入Parkin后引发的mitophagy会使得COXII 降解，从而在胶图上检测到的COXII随时间减少。Fig1c对胶图定量分析的结果显示，五个receptors同时敲除的Penta KO几乎完全阻断了mitophagy现象（此处的Positive control是已知可以block mitophagy的Atg5 KO）。Fig1d/1e又使用mtDNA降解量作为衡量mitophagy程度的指标，得出了一致的结果：Penta KO能破坏mitophagy。

[2] Oligomycin是ATP synthase Fo部分的抑制剂，Antimycin A可以破坏电子传递链的Q cycle。两者都可以破坏氢离子浓度梯度，进而影响线粒体的正常膜电势。那么问题来了：这五个autophagy receptors中哪些是真正会对Parkin通路mitophagy有重要作用呢？为了探究这一点，Fig1f/1g显示了分别向Penta KO中转GFP-tagged的五种autophagy receptors，对于COXII的观察发现只有OPTN和NDP52可以明显的恢复mitophagy。接下来，Youle就将重点锁定到这两个蛋白上面了。

但很奇怪，Fig2a-2d的结果表明，OPTN和NDP52各自的单敲除并不能产生抑制mitophagy的phenotype。这是为什么呢？会不会是因为这两个基因是redundant的呢？双敲除之后果真出现了mitophagy-resistant的表型，支持了这一猜测。[3]

[3]此处的结果成功打脸宾大Erika L. F. Holzbaur 2014年PNAS工作。在这篇PNAS中，Holzbaur报道OPTN RNAi的Hela会呈现出显著降低的mitophagy。

接下来若想继续深挖OPTN、NDP52作用的机理，该怎么办？我很欣赏Youle此处的策略，他将GFP tagged的OPTN、NDP52及相关已经在疾病案例中发现的突变体单独转入Penta KO的Hela细胞中，寻找那些可以恢复mitophagy的情况。通过分析这些关键的位点，Youle发现ubiquitin binding位点对于OPTN和NDP52的正常功能至关重要。

Fig2 还有一个额外的发现：TBK1与OPTN有协同作用。2011年德国团队一篇Science报道了沙门杆菌中TBK1可以将OPTN Ser177磷酸化，在异体吞噬（xenophagy）过程中能促进OPTN与LC3的相互作用。在Fig2g-2j中，TBK1 KO、T/O DKO与WT一样都有正常的mitophagy，但是T/N DKO的mitophagy被抑制——说明在没有NDP52的情况下，TBK1对于OPTN有效介导mitophagy非常重要。在深一步探寻OPTN、NDP52介导mitophagy的过程中，横亘在眼前的一个重要问题是它们聚集到线粒体膜的过程是否需要经过parkin的激活。为了探究这个问题的答案，Youle作出了精巧的实验设计，他将去掉N terminus targeting sequence的PINK1[4]与YFP、2xFKBP融合，表达在缺乏parkin的Hela细胞中。当雷帕霉素衍生物rapalog处理后，FKBP会去结合表达在线粒体膜上的FRB-Fis1，进而将连在一起的PINK也带到线粒体膜附近，PINK发挥激酶作用，将泛素磷酸化。此时若能可以将OPTN、NDP52吸引至线粒体膜上，则说明这一招募过程不需要parkin的激活。

[4]为什么要去掉N terminus？——N terminus存在结合parkin的片段，会引导PINK1结合到线粒体膜上。

如Fig3b所示，正常的OPTN和NDP52都可以translocate到在膜上。此处很好的control是用没有kinase activity的PINK1。为了验证这一recruitment能否引发正常的mitophagy，Youle用上了FACS技术。mKeima[5]可以连在线粒体膜上，当发生mitophagy时，mKeima会进入酸性环境的lysosome中，在488nm激发光下发出荧光。Fig3C所示，OPTN转染的Hela在rapalog处理24小时后有5.29%的是mKeima positive的。

[5]mKeima是一个来自珊瑚可以根据不同pH呈现不同荧光颜色的荧光蛋白，本文所用的Keima来自本蛋白的最早发现者日本的Miyawaki的馈赠。Keima含义是日本将棋中桂马棋子，可以跨越其他棋子移动，与其较大的斯托克斯位移特点吻合。（此解说出自2011年Chemistry&Biology 杂志）

最后，作者对OPTN和NDP52这两个receptors的功能作了进一步探究：

Fig4a研究receptors与LC3的作用关系——在LC3A、LC3B和LC3C中，只有LC3B在DKO中的募集被抑制，由此推断LC3B可能与autophagy receptors有相互作用。

Fig4b/4c研究了DKO对WIPII和DFCPI这两个在LC3上游作用的蛋白的影响。这两个蛋白在DKO的低含量说明receptor 的缺失会影响autophagy 上游的生物合成过程。

Fig4d/4e证明NDP52和OPTN可以募集ULK1从而起始mitophagy的发生。

最后，Fig4f-4i证明了ubiquitin磷酸化也可以直接将ULK1募集到线粒体上。

（二）细胞自噬对细胞核的消化（2015 Letter）

已有的关于细胞自噬的研究主要集中在线粒体等成分，对于细胞核的降解涉及甚少。

这篇2015年Nature letter文章揭示了Lamin B1/LC3介导的将待降解的细胞核输送到溶酶体中消化的可能机制。

如何寻找一个突破口呢？本文作者宾大的Berger和格拉斯哥大学的Adams采用了一个“钓鱼”的策略。他们用已知的在核内表达的LC3B（连接GST tag）作为“钓饵”，先pull-down[6] 核组分，发现了laminB1这个上钩的鱼儿（Fig1b）。之后1d/1e又用co-IP确认了LC3B与Lamin B1之间存在相互作用。 [7]（Fig1f 套路地用突变的LC3B没能将lamin B1 拉下来）

[6] GST缺点：动物细胞内含有内源的GSH

[7]两个疑问：第一，SE和LE分别代表short exposure和long exposure，什么意思？第二，co-IP相比pull down assay，能否得出新的结论？为什么要show两个实验的结果？只显示pull down assay的话，reviewer会有哪些可能的argument？

下一步问什么问题？

2008年荷兰阿姆斯特丹癌症研究中心团队的Nature Letter报道了Lamin B1会与一段叫做LAD的DNA序列发生相互作用。此处使用了ChIP的实验方法——本质与co-IP一样，只不过目的由研究蛋白-蛋白相互作用变成了蛋白-基因相互作用。因此在用GFP抗体拉下GFP-LC3B后，对此混合成分进行qRT-PCR测量感兴趣的LAD序列的含量（negative control是beta-actin）。他们之后还对ChIP结果进行了测序，使用了一种叫做EDD的算法。

总之，Fig2说明了LC3能与染色体上的LAD序列发生相互作用。

这一蛋白-DNA相互作用有什么生物学意义呢？

首先，作者用无血清培养基和雷帕霉素分别处理，发现都不能下调Lamin B1的表达量。由此他得出饥饿压力不会引起核组分Lamin B1的降解。那致癌信号能否激活Lamin B1的降解呢？HRasV12的转染在Fig3b中观察到了Lamin B的下调（优秀的negative control：Lamin的其它isoform）。

接下来的实验设计我认为非常机巧：他们构建了mcherry-GFP-Lamin B1融合蛋白。当B1没有发生降解时，核内的中性pH会同时观察到mcherry、GFP的荧光；当B1发生降解进入lysosome时，酸性环境会使GFP发生淬灭（Dr. Yang’s comment：此过程可逆。），只呈现出mcherry的荧光。由此可以间接的反映B1是否发生了降解。3c／3d的结果表明：致癌信号HRasV12可以引发细胞质中B1含量的显著增加。再加上3e补充的TEM图像，Fig3说明当细胞产生致癌信号后，lamin B1会成为细胞自噬的底物，通过nucleus-to-cytoplasm被传输到lysosome进行降解。

哪些因素会影响lamin B1的降解呢？首先autophagy正常工作的蛋白都一定是必要的。Fig4a用sh-Atg7 RNA hairpin通过抑制LC3B的形成成功阻遏了Lamin B1的降解。（此处加OHT是为了引发Ras上调）其次，LC3B与LaminB1的相互作用也很有可能是必要的：Fig4b找到了LC3关键的结合部位R10和R11；4c/4d采用二分法找到了Lamin B1 370-458这个氨基酸片段对于LC3B-LaminB1相互作用是充分且必要的。Fig4e将mcherry-GFP-LB1 390-458外源肽段转入HEK293细胞，通过co-IP证明其可以与内源的LC3B发生相互作用（先用LC3的抗体做IP，之后看anti-GFP 有条带）。

经过层层铺垫，终于在Fig4f中显示了向HRasV12细胞中加入mcherry-GFP-LB1 390-458外源肽段的结果——与control mCherry-GFP相比，Lamin B1条带没有变暗，说明很可能是外源的片段通过竞争与LC3B的结合破坏了内源正常的LC3B－LaminB1相互作用，进而阻遏了由Ras引发的Lamin B1的发生。

在文章最后的Fig5中，再次说明该相互作用的重要生物学意义。通过构造的点突变找到了重要的氨基酸，并再一次验证相互作用的缺失会阻遏Lamin B1降解的发生。Fig5c/5d/5e/5f通过colony formation analysis想说明Lamin B1 mutant cells会更容易癌变。[8]而注入B1370-458片段可以有一定程度的挽回。

[8] 在colony formation analysis中，琼脂糖凝胶会抑制细胞的贴壁，故一般细胞无法生长。但癌细胞不需要贴壁就可以增殖，因此细胞量反映癌细胞增殖情况。

最终，Fig5h展示了本文的结论：LC3会结合Lamin B1，并将其从核内运出，送到cytoplasm的lysosome降解。

（三）细胞自噬选择性的实现（2015 Nature Letter）

最后，王闽铭介绍了Ohsumi 2015年的Nature工作。Ohsumi在本文开始也做起了渔翁，在他最拿手的面包酵母中下饵：他的目的是寻找酵母中可以与Atg8发生相互作用的蛋白。他直接用Atg8 IP整个酵母中的组分，对其进行了质谱分析[9]，寻得了Ylr312c和Yor152c两个蛋白，名之曰Atg39、Atg40[10]。

[9] 旁人皆将tag加在Atg8的N terminus，打质谱而不可得；Ohsumi独辟蹊径，将tag接在C terminus，寻得宝物无数，此文仅显示两个。

[10] 质谱分析的raw data在哪里？怎么可能与Atg8存在相互作用的未知蛋白只有两个？（Ohsumi想必发现了许多宝贝，区区抛出两件便化为一篇Nature。）Fig1b用co-IP和酵母双杂交[11]确认了Atg8与Atg39、Atg40的相互作用，还构建了关键基序突变的Atg39、Atg40的肽段，未能观测到相互作用。[12]

[11] Atg39、Atg40含疏水跨膜区，但酵母双杂交可行，怪哉。

[12] 诡异：ATG39-HA处为何出现两条带？——磷酸化作用√，加了磷酸基团虽然带有负电，但由于可能与SDS基质存在电荷相互作用，从而使得磷酸化后在胶图上跑得更慢一些。（机制很谜～）

那么Atg39、Atg40有哪些功能呢？首先当然看看饥饿条件下这两个蛋白含量的变化：加入雷帕霉素降低TORC1活性，进而模拟氮养分缺乏的条件。从Fig2a可以看出缺氮条件引发了Atg39和Atg40的上调[13]。

[13] Pep4作用：诸多水解酶上游的调控开关根据2005年Ohsumi的文献，在此条件下可以观测到内质网的降解。那Atg39、Atg40会不会是介导内质网在缺氮条件下降解的关键分子呢？

如何观测内质网降解呢？此处Ohsumi向酵母中转染Sec63-GFP融合蛋白，Sec63是一种内质网膜蛋白，可以将GFP一起定位在内质网膜上。当内质网被运到溶酶体进行降解时，会产生protease-resistant 的GFP[14]片段。通过观察由消化产生的GFP含量可以间接反映内质网的消化程度。Atg39 KO、Atg40 KO呈现出部分的降解被抑制现象，而两者都敲除的DKO则达到了和positive control Atg1 KO接近的“完全抑制降解”效果。[15]

[14]GFP这一不被蛋白酶水解的特性很神奇（经验上的套路，Roger Tsien听说这个性质应该会感到很欣慰）

[15] 套路：如何知晓phagosome是否封口？——FLIP assay判断是否GFP可以扩散。由这一结果我们可以推测：Atg39和Atg40在介导ER degradation 过程中应该有相对独立的不同作用。Fig3显示了一系列电镜照片，意在说明两种蛋白会在ER的不同subdomain中定位——Atg39主要和pnER结合，Atg40主要和cER/cytoER结合。[16]

[16] 此处图像质量差评（smear：液泡较强自发荧光背景——用实验时需要有无GFP control）

为了进一步确认电镜下观测的结果，Fig3d/3e用不错的生化实验提供了证据：Hmg1是已知在pnER特异性表达的蛋白，故通过Hmg1-GFP的降解程度来衡量pnER的降解程度——如Fig3d所示，Atg39 KO几乎完全抑制该降解过程，而Atg40 KO则还有很大的降解量；同理，Rtn1作为cytoER的标志，在fig3中被用来衡量cytoER的降解程度。

Fig3f-3J非常糟糕的电镜结果企图说明pnER自噬产生“double ring pattern”，由Atg39介导、cytoER自噬产生“sheet pattern”，由Atg40介导。可惜像素实在令人堪忧，人眼很难辨识其中的pattern。

各位看官谨记：细胞自噬领域一个很重要的问题是phagosome形成过程之谜。本文Ohsumi也想探究一下ER-phagy形成phagosome的膜来源于哪里。

Double membrane的内外膜最可能来源于pnER的内外膜。为了验证这一点，Ohsumi观测了Src1-GFP（inner nuclear membrane protein）和Hmg1-GFP（outer nuclear membrane protein）的降解情况。Fig4b又显示了Nop1这一核内蛋白的降解，由此推断核内一些蛋白组分也可能参与组建phagosome的膜。

Fig4d-4f考察了一些Atg39、Atg40缺失产生的表型，比如细胞的活力。此处得到的结论是Atg39突变体在缺氮源条件下更易发生细胞坏死，可能原因是pnER-phagy通路的故障；而Atg40则没有显著的差异，说明cytoER-phagy通路对于缺氮源的环境压力不是非常关键。

讨论环节，魏铮同学对此次JC进行了总结。自从20世纪90年代许多与自噬相关的基因的功能被逐渐阐明，自噬分子机制逐渐明晰，一些其他领域的科学家开始试图从他们的研究领域出发，研究自噬与疾病的关系，例如自噬与神经退行性疾病、衰老、癌症、免疫、肝病、心脏疾病的关系。魏铮同学举例介绍了三项自噬与疾病的相关研究，分别是Atg7介导线粒体自噬保持骨骼肌卫星细胞干细胞性（抑制自噬可以加速干细胞衰老）、果蝇眼触角盘瘤的癌细胞通过促进周围细胞自噬为自身增殖提供氨基酸、细胞自噬在免疫系统中的作用（小鼠中细胞自噬受体p62介导的线粒体自噬可以抑制炎症反应，避免过度炎症反应）。

讨论结束后，杜立林老师和李卫老师对此次JC进行了点评，他们表示，同学们讲解文献的清晰程度不亚于他们实验室的研究生同学，自噬这个领域正在走向成熟，基本的框架已经架成，但关于自噬与疾病的临床研究还有待跟进，他们告诫同学们，在阅读文献时，除了正文以外，还应该更多地去关注实验方法，要能从文章中努力还原出做研究时原本的思路。

同学们一起合影留念，在细胞自噬的热烈讨论中度过了一个愉快充实的周末上午。预告：2017年3月4月2日上午10点，挑战班诺贝尔奖工作讨论系列专场将在王克桢楼348继续进行。周鼎翕、魏泽林、董梓琪、白珂四位同学将为大家带来2009年诺贝尔生理学奖端粒酶研究领域的精彩介绍，大家敬请期待～

参考文献

1、Lazarou, M., Sliter, D. A., Kane, L. A., Sarraf, S. A., Wang, C., & Burman, J. L., et al. (2015). The ubiquitin kinase pink1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature, 524(7565), 309-14.
2、Mochida, K., Oikawa, Y., Kimura, Y., Kirisako, H., Hirano, H., & Ohsumi, Y., et al. (2015). Receptor-mediated selective autophagy degrades the endoplasmic reticulum and the nucleus. Nature, 522(7556), 359-62.
3、Dou, Z., Xu, C., Donahue, G., Shimi, T., Pan, J. A., & Zhu, J., et al. (2015). Autophagy mediates degradation of nuclear lamina. Nature, 527(7576), 105.
4、Yang, Z., & Klionsky, D. J. (2010). Eaten alive: a history of macroautophagy. Nature Cell Biology, 12(9), 814.

编校|夏宁静 魏铮 焦中罡 王闽铭&宣传部同学

编辑|韩瑾仪

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