创新 Science, Nature, Cell发布神器—冷冻电镜
创新鉴赏 图11.背景
结构生物学是诞生于上个世纪中叶通过研究生物大分子的结构与运动来阐明生命现象的学...
创
新鉴赏
图1
1.背景结构生物学是诞生于上个世纪中叶通过研究生物大分子的结构与运动来阐明生命现象的学科。在过去半个世纪里,X射线法解析生物大分子结构一直占据结构生物学的统治地位。而近年来,冷冻电镜在研究生物大分子结构尤其是超分子体系的结构方面取得了突飞猛进的发展。该技术它可以快速、简易、高效、高分辨率解析高度复杂的超大生物分子结构,在很大程度上取代并且大大超越了传统的X射线晶体学方法。
图2:X射线衍射法
图3:冷冻电镜法
2.冷冻电镜原理
冷冻电子显微学解析生物大分子及细胞结构的核心是透射电子显微镜成像,其基本过程包括样品制备、电子显微镜成像、图像处理及结构解析等几个基本步骤。
图4:冷冻电镜解析结构步骤
透射电子显微镜成像过程中,电子束穿透样品,将样品的三维电势密度分布函数沿着电子束的传播方向投影至与传播方向垂直的二维平面上。1968年,Aron Klug发现中心截面定理,提出可以通过三维物体不同角度的二维投影在计算机内进行三维重构来解析获得物体的三维结构。根据这一原理,利用透射电子显微镜获得生物样品多个角度的放大电子显微图像,即有可能在计算机里重构出它的三维空间结构。
图5:三维重构原理图
3.冷冻电镜制样
图6:FEI vitrobot 冷冻制样机
常规的冷冻方式冷却速度缓慢,冷却过程中,蛋白质水溶液会因结晶而变形扭曲,造成生物分子的结构的破坏。快速冷冻制样是将样品快速放入液氮冷却的液态乙烷中,由于冷却速度快,使得水分子还来不及结晶就被固定住,整个冷冻过程在数毫秒之内就完成了(冷冻速率>104℃/s),冷冻好的水以玻璃态存在,不存在晶体结构,能使蛋白质结构保持其天然结构状态。
图7:样品在液氮中冷冻
冷冻制样是目前结构生物学领域最好的样品制样方法,相对于传统的制样,其特点主要有:
- 高速冷冻过的玻璃态水中,样品水合状态得以保存,结构不受破坏;
- 可获得高分辨率的结构数据,分别率可达0.2nm;
- 可降低样品的辐射损伤;
- 样品准备较复杂;
- 衬度较差。
图8:蛋白质颗粒随机分布在玻璃态水中
4.冷冻电镜成像
冷冻的样品冷冻输送器转移到电镜的样品室,在电镜成像之前,需确认样品中的水处于玻璃态。由于生物样品对高能电子的辐射敏感,成像时必须使用低剂量技术(
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