全长16S rRNA精析珊瑚附着菌群，就是这么简单

珊瑚的生态系统有点复杂，这其中有共生菌群的一份力...





文章首次用PacBio测序得到的全长16S rRNA序列分析海洋环境样本，对附着在石珊瑚上的细菌群落组成及结构进行精确解析，发现不同海洋区域的石珊瑚上细菌群落组成存在明显的差异性，同时也反映了基于PacBio测序的全长16S rRNA序列分析在珊瑚附着细菌群落中种的分类鉴定中的优势。

珊瑚礁是一个复杂的生态系统，包含了珊瑚虫和大量的共生生物，如腰鞭毛虫，真菌，病毒和细菌。已有研究表明附着在珊瑚上的细菌对珊瑚的生存有重要作用。本研究基于PacBio测序的环形一致性序列CCS Read在微生物群落多样性分析的优势，对印度-西太平洋中附着在石珊瑚上细菌群落多样性及结构进行分析鉴定。

1. 样本采集：采样区域位于印度西太平洋，分别采集泰国海湾（MN, TL, TA），安达曼海 (MT, SM, TC)共6个位点（Figure 1），每个位点取三个平行样，共18个样本。

2. 全长16S rRNA扩增子测序：

（1）采用的是两步法进行全长16S rRNA扩增：第一步用16S rRNA通用引物扩增，第二步加barcode序列（Figure 2）;

（2）构建两个文库，每个文库包含9个样本，分别测12个Cells，共24个Cells，上机PacBio RS II，P6C4。

3.    进行全长16S rRNA的数据分析。1.24个Cells共产出28.15Gb，polymerase read的平均读长为25.4Kb，CCS序列平均覆盖圈数为21.2，数据质控后共生成571,710条CCS，平均每个样本约31,761条，质量值在99%以上（Table 1）。

2.  对各样本进行OTU和alpha多样性统计（Table 1），其中MN1的OTUs最多，而SM3的OTUs最少。虽然附着在各位点石珊瑚上的细菌多样性不同，但整体看来泰国海湾的多样性要比安达曼海高（Figure 3）。

3. 不同生境对附着在石珊瑚上的细菌群落组成有显著影响

对OTUs进行分类鉴定，结果显示在所有样本中变形菌门为最优势种群（Figure 4），其中Alpha-, Beta-, Delta-, Epsilon- 和Gamma-变形菌纲最为常见，但在泰国海湾和安达曼海两个海域中的丰度差异很大。在安达曼海的各样本中（MT, SM, TC），76%的序列来自Gamma-变形菌，而泰国海湾的样本则主要为Alpha-变形菌（TA, TL）和Epsilon-变形菌（MN）。

多样本相似度树状图显示附着在不同位点石珊瑚上的细菌群落组成有很大的差异，来自安达曼海的样本中优势种群是Gamma-变形菌纲中的螺菌目（河氏菌科）和弧菌目（假交替单胞菌科），而泰国海湾的样本中细菌组成要复杂很多，如弯曲菌目，黏胶球形菌目，梭菌目，红螺菌目，Ellin329和腐螺旋菌目（Figure 5）。

4. 不同位点与石珊瑚相关的特有菌群

采用INDVAL的方法分析不同位点与石珊瑚特异相关的细菌种群，结果显示MN点含有大量的特有种群，一半为alpha-变形菌纲的红杆菌科（Aliiroseovarius, Leisingera, Roseovarius, Thalassobius 和 Tropicibacter），TA点和TL点的大部分特有种群为gamma-变形菌纲，而来自安达曼海的样本的特有种群相对丰度都较低。

5. 石珊瑚相关的共有菌群

进行三个梯度的分析：一为50%样本（即9个样本），都含有的细菌有98种，大部分为gamma-变形菌纲（71%）和alpha-变形菌纲（11.5%）; 二为75%样本（定义为核心种群），都含有的细菌有36种，分布在21个属，主要是gamma-变形菌纲的弧菌科，河氏菌科，假交替单胞菌科和噬几丁质菌科; 三为100%样本，都含有的细菌有9种，为alpha-变形菌纲 （Caulobacter vibrioides, Bradyrhizobium rifense, Prosthecomicrobium hirschii, Reyranella massiliensis), Gamma-变形菌纲 (Endozoicomonas elysicola, Endozoicomonas euniceicola, Endozoicomonas numazuensis, Nevskia terrae) 和 拟杆菌纲 (Sediminibacterium salmoneum)（Figure 6）。

6. 从全长16S rRNA序列中截取出V3-V4区域和V5-V6区域，并分别进行相应分析，结果显示99.7%的全长16S rRNA序列可以被鉴定到“种”的分类级别，而根据V3-V4区域能鉴定到“种”的占32%-93%不等，根据V5-V6区域能鉴定到“种”的占71%-90%不等（Figure 7,8），总而言之，覆盖了所有可变区的全长16S rRNA序列相对部分可变区，将更能用以精确分析和鉴定菌群。

相对短读长获得的16S rRNA序列的部分可变区域，全长16S rRNA序列更能精确的分析菌群多样性，而基于PacBio测序获得的全长16S rRNA序列，相对Sanger测序而言，更经济，通量更高。随着PacBio测序平台通量和读长不断更新，将为微生物群落多样性和结构的精确鉴定和研究提供了一种经济高效的方式。

未来组作为世界领先三代测序基因组中心，不断寻找PacBio SMRT测序技术在科研中的创新应用，已于2016年开发了基于PacBio测序的全长16S rRNA扩增子测序和宏基因组分析，积累了大大小小的PacBio测序的微生物群落结构分析的项目经验。未来组将借助Sequel技术平台优势进一步为研究者提供经济高效的微生物群落研究的解决方案。

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参考文献

PootakhamW, Mhuantong W, Yoocha T, et al. High resolution profiling of coral-associatedbacterial communities using full-length 16S rRNA sequence data from PacBio SMRTsequencing system[J]. Scientific Reports, 2017, 7.

文案：谢美丽

审核：周红梅

编辑：张芳芳

图片来源于网络｜侵删

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