转录组基因剪接

未来组最新Paper：全长转录组研究新工具HySeMaFi

无参考基因组的转录组研究怎么做？看这里！...

由华中农业大学园艺林学学院研究团队主导的，未来组参与的全长转录组分析项目文章，近日发表于Scientific Reports。研究通过结合全长转录组Iso-Seq和RNA-Seq两者优势，针对无参考基因组物种的转录组分析开发了HySeMaFi流程，该流程可对基因剪接形式进行挖掘，并精确定量isoform表达等。

二代测序RNA-Seq是研究基因表达重要工具，然而，由于其读长短，并不能完整重构转录组中isoform全长，更无法对可变剪接进行深入分析，尤其在无参考基因组的转录组研究中更为明显。目前，很多研究将PacBio SMRT测序的长读长用于有参考基因组物种的转录组分析，以确定其中广泛存在的可变剪接形式，而在无参考基因组物种的转录组分析中，并无更好的方法或研究策略用于可变剪接或isoform的准确定量等分析。

在本次研究中，研究者基于RNA-Seq和三代全长转录组测序开发了HySeMaFi（hybrid sequencing and map finding），克服了RNA-Seq中不完善的isoform重构形式，同时，也可定量isoforms表达，为后续研究提供准确的参考基础。

研究方法

1. 收集9株矮牵牛的4个组织：根（命名dangen）、茎（命名danjing）、叶（命名danye）和花（命名danhua），提取RNA，反转录为cDNA，分别构建文库：Miseq （PE300）、Hiseq （PE100）和PacBio RSII SMRTbell（1–2 kb, 2–3 kb，共6个Cells），上机测序。

2. 二代RNA-Seq数据进行组装，得到Contigs（经低阈值和默认参数的Trinity组装）；三代Iso-Seq数据校正后得到高质量全长转录本（经ICE和Quiver校正；结合短读长，经LSC校正）；对全长转录本和组装的Contigs进行mapping finding。

3. 基于2，进行可变剪接分析及isoform差异表达分析。

研究结果

1. 基于RNA-Seq和Iso-Seq两种测序策略，开发HySeMaFi分析方法，示意图见Fig. 1。在RNA-Seq中，经不同组装方法拼装出所有理论上的isoforms形式（涵盖有真实的Isoforms形式），同时在Iso-Seq中经过校正得到A,B两种isoforms。通过比对方法，建立RNA-Seq中 longest molecules（如图中 1***）和PacBio corrected reads比对关系，用于后续下游分析，如得到的longest molecules和PacBio corrected reads可用于分析可变剪接形式，PacBio corrected reads可作为参考基因集做后续基因表达分析。

Fig. 1 HySeMaFi方法（hybrid sequencing and map finding ）示意图

2. PacBio数据经聚类，80% isoforms聚类的cluster含有2个以内isoforms形式，同时也发现100个以上cluster含有50个isoforms形式（Fig. 2a）。经HySeMaFi方法得到的转录本，如组装的longest molecules 和PacBio corrected reads，除了可能的外显子对应的基因isoforms外，至少有2,264基因有2个以上可变剪接形式(Fig. 2b)。为验证，以Miseq数据作为query，比对到Hiseq数据的longest Contigs，结果与基因分析中长读长作为数据集的结果一致（Fig. 2c 和Fig. 2d）。

Fig. 2 经HySeMaFi方法全方位确定基因可变剪接形式

3. 以LSC校正后的85,571 unique reads为参考基因集，对花、茎、叶和根组织基因表达进行分析。与花、茎和叶组织相比，根部有2,904，1,618和3,868个isoforms表达量显著增加，其中639个转录本在根部表达最为显著（Fig. 3a和Fig. 3b）。同时，与花、茎和叶组织相比，根部有1,967，1,219和2,780个isoforms表达量显著降低，其中869个转录本在根部表达最为显著（Fig. 3c和Fig.3d）。

Fig. 3 以HySeMaFi方法得到的基因为参考，对根、茎、叶和花中基因表达进行分析

4. 仅经RNA-Seq，聚类去冗余后，最后得到193,749个转录本用做参考基因集，比较以RNA-Seq与Iso-Seq获得的基因集为参考的基因表达，发现前者的部分转录本在聚类过程中被去掉了，两者在基因表达并不一致（Fig. 4e 和Fig. 4f）。而在两者中都有的转录本，表达情况一致（Fig. 4g和Fig. 4h）。

Fig.4 以PacBio corrected long reads与RNA-Seq的contigs为参考的基因表达情况对比

通过结合RNA-Seq和Iso-Seq，开发的针对无参考基因组的HySeMaFi分析流程，在转录组分析中，可挖掘更多基因可变剪接形式及精确定量isoforms的表达。未来组基于丰富的全长转录组项目经验，针对特定项目，对分析流程进行优化，以期为不同领域的研究者提供更为完善的解决方案。

参考文献

Guogui Ning, et al. Hybrid sequencingand map finding (HySeMaFi): optional strategies for extensively decipheringgene splicing and expression in organisms without reference genome. Scientific Reports. 2017, 7: 43793.文献下载，请移步“阅读原文”

文案：周红梅

审核：梁帆

编辑：张芳芳

图片来源于网络｜侵删

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