基因治疗：创新多重技术组合，严控腺相关病毒（AAV）质量

--基因治疗与AAV--基因治疗是指将，外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因，引起的疾病，从而达到...

--基因治疗与AAV--

基因治疗是指将，外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因，引起的疾病，从而达到治疗目的。所有基因疗法都利用病毒或非病毒载体将DNA或RNA输送到宿主细胞中。与非病毒载体（如阳离子脂质或化学载体）相比，病毒载体感染宿主细胞的，效率更高，但同时它们可能，具有免疫原性副作用。因此，在开发药物时，选择合适的病毒载体是，至关重要的组成部分。

腺病毒相关病毒(Adenovirus Associated Virus，AAV)

AAV是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和，溶细胞性感染。腺相关病毒（AAV）作为一种安全有效的载体，目前已应用于多个临床，试验。

临床研究项目中AAV1和AAV2约占50%

--质量控制--

--wes全自动，定量western Blot

在AAV生产过程中，使用SDS-PAGE通过Western Blot来鉴定蛋白。然而，传统的Western Blot手动操作繁琐，重复性差，并且仅是半定量，不宜用于工业产品质量，控制。

wes全自动定量western以其独特优势，逐渐替换传统western blot，可用于新型AAV衣壳的表达到下游制造全程质量控制中。

鉴定衣壳蛋白VP1/2/3

鉴定杂质

筛选抗体

检测动态范围

将市售AAV2（1x1013 GC/mL，33.8μg/mL）进行从1：8至1：256的2X倍比稀释，Wes检测VP1/VP2/VP3。

--Maurice表征AAV电荷异质性

与所有治疗药物一样，基因疗法，需要表征包装药物的，递送载体电荷等。使用全柱成像毛细管等电，聚焦电泳法（icIEF）来表征AAV的电荷异质性，可以确保产品的稳定性，和一致性。

Maurice兼具CE-sds和icief，双功能。两种功能均入选国家药典。

自发荧光和紫外吸光度比较

Maurice同时兼具紫外吸光度和自发荧光检测通道。与吸收检测相比，自发荧光的灵敏度高3-5倍，可以更好检测出，aav特征性异构体峰。因而自发荧光模式更适合AAV病毒电荷表征。

Intra-assay CV

AAV2和AAV6样品一式四份进样，检测Intra-assay重现性（图2）。结果显示其高重现性：AAV2和AAV6的％RSD分别为3.95％和4.30％（表1）。

Inter-assay CV

AAV6样品三次独立实验，每次实验三次重复，来检测Inter-assay重现性（图3）。％RSD为6.6％（表2）。

变性AAV蛋白电荷表征

AAV病毒蛋白会进行几种翻译后修饰，包括糖基化和脱酰胺作用。应激引起的病毒蛋白脱酰胺作用，可能导致载体活性，衣壳装配和转导效率降低1。icIEF方法通常用于监测由唾液酸化，糖基化和脱酰胺作用诱导的单克隆(单克隆，)抗体的电荷异质性，因此对AAV病毒蛋白也进行类似的评估。使用一式三份电泳图叠加使用，吸光度和自发荧光检测法进行评估，AAV2电荷变异体可以清晰分辨和重现（图4）。

灵敏度及线性

将变性的AAV2从〜3 x 1012 GC/mL连续滴定至〜3 x 1011 GC/mL（图6）以建立方法的灵敏度。该滴定范围内观察到很强，的线性相关性，R2为0.9956。

监测AAV颗粒稳定性

对完整的AAV样品进行温度压力测试，以确定是否可以使用Maurice监测病毒载体的稳定性或衣壳蛋白脱酰胺。

AAV6颗粒非常稳定，在37°C或50°C下保持10分钟完整无缺。但是，当AAV6颗粒在60°C下10分钟时，不稳定。

监控AAV批间差

利用Maurice icIEF天然荧光监测批次间变异，以鉴别病毒载体批间差别。五批不同的AAV6，每批具有不同，的基因组含量/mL（GC/mL），Maurice icIEF自发荧光分析（图9）。结果显示，所有五个批次在pI〜9.25左右均产生相似的峰形。但是，在一批中观察到了一个较低pI的附加峰，表明该样品与其他四批，样品不同。

主要参考资料

1. Deamidation of amino acids on the surface of adeno-associated virus capsids leads to charge heterogeneity and altered vector function, AR Giles, JJ Sims, KB Turner, L Govindasamy, MR Alvira, M Lock, JM Wilson, Mol Ther, 2018; 26(12):2848-2862.

2.Dan Wang, Phillip W. L. Tai and Guangping Gao，Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery，Nature Reviews Drug Discovery，2019