普外专题三十二：安可晶局部固定干细胞

安可晶因为可以促进细胞包括干细胞的黏附与增殖，生物相容性好，已被作为多种药物、细胞及细胞因子的缓释载体。再生医学近年取得了飞速的发展，安可晶为干细胞和免疫细胞提供基质及三维的培养空间，提高细胞的存活率。...

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张雪莲、马依彤、王常勇、马翔、

阿迪拉•阿扎提、刘芬、陈邦党

引   言

原位心肌组织工程在近年取得了飞速的发展，它是指利用可注射的生物支架材料携带细胞、生物活性分子直接植入心肌以修复受损心肌，为细胞提供基质及三维的培养空间，提高细胞的存活率。 脂肪干细胞 ，因为具有来源广泛，取材安全方便和扩增速率高，目前应用前景更为广泛，是组织工程研究中新的种子细胞来源之一。

对于组织工程基质材料的选择，目前所采用的可注射生物材料有纤维蛋白胶、藻酸、葡聚糖、壳聚糖等。由于其损伤小，可根据注射部位塑形不会改变心脏解剖学形状而成为研究热点。纤维蛋白胶因为可以促进细胞包括干细胞的黏附与增殖，生物相容性好，已被作为多种药物、细胞及细胞因子的缓释载体。新近研究评价了鼠胚胎干细胞来源的神经细胞在纤维蛋白胶中的存活和分化情况。目前国内外研究未见脂肪干细胞在纤维蛋白胶中培养时的增殖和存活性研究。

实验在成功分离培养大鼠脂肪干细胞的基础上，与纤维蛋白胶复合三维培养，观察ADSCs在纤维蛋白胶中的增殖和存活性，为可注射的组织工程化心肌移植治疗心肌梗死提供实验依据。

1 材料和方法（略）

2结果

2.1  脂肪干细胞的形态学变化



原代培养的ADSCs较杂，呈圆形。接种后24h，部分细胞已贴壁，48 h后细胞伸展变形，呈梭形或多角形改变，5~7 d可达90%融合。传代细胞24  h内基本贴壁，呈均一的长梭形，增殖迅速，呈鱼群样或涡旋状生长。

2.2  流式细胞术检测细胞表面抗原

体外培养的第3代细胞，其表面标志CD90和CD105呈阳性表达，造血干细胞和淋巴细胞的标志CD34、CD45表达阴性，结果显示ADSCs具有间质干细胞的表型特征，



2.3脂肪干细胞在纤维蛋白胶中的增殖

与对照组相比，纤维蛋白胶组培养的ADSCs随天数增加增殖活性增强，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1





 

2.4   脂肪干细胞在纤维蛋白胶中的存活检测

      经LIVE/DEAD荧光双染色观察，活细胞表达绿色荧光，死细胞表达红色光。ADSCs在纤维蛋白胶中培养24  h后即可见ADSCs附着在凝胶中，生长变形。培养72  h后，可见ADSCs在凝胶中伸展为梭形、多角形，相互交联。到第5天仍增殖状况良好。荧光显微镜下可见呈绿色荧光的活细胞数随时间增加，数量逐渐增加，而死细胞数无明显增加，



培养24，72 h时存活率均在90%以上，细胞死亡率小于7%，



3 讨论

      近年来，利用可注射的生物材料携带细胞移植于缺血的心脏，以修复损伤的心肌成为组织工程研究的热点。关于种子细胞的来源，文献报道多采用骨髓间充质干细胞作为细胞来源，但自2001年Zuk等从人脂肪组织中分离获得了ADSCs，发现其具有多向分化潜能，且免疫原性低，已有动物实验显ADSCs移植可以促进肌梗死后的血管新生和心脏功能改善，这就为心血管疾病的治疗带来了新的途径。实验从大鼠腹股沟脂肪成功分离干细胞，经流式细胞仪鉴定其表面标志CD34、CD45阴性，CD90、CD105阳性，与Schaffler等报道的结果相似。培养过程中细胞增殖迅速，按1∶3传代平均四五天可传代1次，能连续传代达15代以上。而将纤维蛋白胶与脂肪干细胞复合培养，MTT结果显示纤维蛋白胶明显促进了脂肪干细胞的增殖。其机制是什么仍然是不明确的，可能与纤维蛋白胶自身成分有关，纤维蛋白胶中含有的ⅩⅢ因子也具有刺激细胞增殖的作用，对缺血后的心肌修复具有促进作用。

       有研究应用FDG-正电子发射计算机断层扫描(FDG-PET)检测乳鼠心肌细胞在纤维蛋白胶中培养时的存活性，结果显示心肌细胞代谢增强，细胞存活增加。实验通过LIVE/DEAD荧光双染色可见呈绿色荧光的活细胞数随时间增数量逐渐增加，细胞存活率在24 h和72  h时均在90%以上，死亡率小于7%。说明纤维蛋白胶与脂肪干细胞之间生物相容性良好，可以用纤维蛋白胶携带脂肪干细胞用于组织工程心肌的研究。LIVE/DEAD荧光染料是基于钙黄绿素AM和溴化乙啶同型二聚体1的一种同时检测死细胞和活细胞的双染荧光染料，用于测量细胞内酯酶的活性和细胞膜的完整性。当透膜的钙黄绿素AM被活细胞的酯酶裂解后会使细胞质带绿色荧光，而不能透膜的溴化乙啶同型二聚体1可标记膜受损细胞的核酸，使其带红色荧光，适用于动物细胞的快速分析。目前多利用扫描电镜来观察支架材料上生长的细胞形态，实验利用LIVE/DEAD荧光双染色体外评价纤维蛋白胶中三维培养的脂肪干细胞，可见细胞形态清晰、相互交联。利用此法检测较扫描电镜简便易行，节省费用。只是实验浓度较试剂盒浓度需提高1.5倍。实验采用大鼠脂肪干细胞与纤维蛋白胶三维培养，可见其增殖好，细胞存活率高，为可注射的纤维蛋白胶携带脂肪干细胞移植奠定了实验基础，并为临床应用提供了理论依据。

 

摘自：《中国组织工程研究与临床康复》

第14卷 第47期 2010-11-19

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