干货丨用Jspecies软件进行平均核苷酸相似性（ANI）分析

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在可用于鉴定细菌基因组亲缘关系远近的方法中，平均核苷酸相似度（average nucleotide identity）是其中最强有力的测量指标之一。所谓平均核苷酸相似性，这是基于两两基因组之间所有直系同源蛋白编码序列比较的一个平均值，这个平均值反应基因组之间进化距离关系。和其它两种常用方法（DNA-DNA杂交，简称DDH，以及16S rRNA序列分析）相比，ANI平均值达到95%时相当于DDH值的70%、16s rRNA基因相似度的98%。根据此前研究中对7个属、16个种及5个亚种的代表性芽孢杆菌菌株ANI值的分析，可将ANI值作为属间鉴别的值定为50%-65%，种间鉴别的ANI值定为65%-90 %，亚种鉴别的ANI值则定为90%-96%；当ANI值高于96%时，可结合其它特征进行亚种分析。而且ANI与作为原核生物基因组中基因组标签的四核苷酸（Tetra）具有相关性。

ANI值的计算可以通过几种不同的软件来实现 ，Jspecies是其中较常被使用的一种，其下载地址为：http://imedea.uib-csic.es/jspecies/。为计算并鉴定直系同源基因，还要附加安装两个软件：BLAST和MUM mer。BLAST软件链接：ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast /，MUMmer软件链接：http://mummer.sourceforge.net/。

Jspecies软件的使用：

打开软件点击Edit下的preferences按钮，可将工作目录，BLAST、nucmer软件等链接过来，如下图：



可对ANIb（基于BLAST得到的ANI值）和ANI m（基于MUMmer得到的ANI值）参数进行修改如下图：




导入数据进行计算，如下图：



数据可以从NCBI中下载，也可以导入本地保存的数据

根据图中数据可知Query序列将被切为1020 bp的碎片段与Subject序列对应区域进行比较

ANIb值：为相似度总值的平均值，结果大于96%的显示绿色，小于96%的显示红色；

ANI Alignment：表明参与比较的片段数和其所占总片段数的百分比；

ANI Aligned:比对上的核苷酸数和其所占总序列核苷酸数的百分比；



上图为Query和Subject序列用mummer软件进行比较后ANIm值的结果

ANIm Aligned：表明用于计算的核苷酸数和其所占序列总核苷酸数的百分比；

ANIm Non-Identical: 表明未用于计算ANI值的核苷酸数和其所占的百分比；

ANIm值：表明全部用于计算的核苷酸和其所占参与计算的核苷酸数（ANIm Aligned）的百分比，大于96%的显示绿色，小于96%的显示红色；

ANIm Alignments: 参与计算的片段数（不论长度大小）；



上图为Query和Subject序列中四核苷酸（Tetra）的比较结果，图上的表格展示的是Query和Subject序列中四核苷酸（Tetra）特征性的分布情况。Regression值是根据 Query序列Z-score（y轴值）和Subject序列Z-score（x轴值）进行的线性相关系数的计算结果，计算公式如下面网址所示：http://www.baike.com/wiki/相关系数。

看，Jspecies的使用和ANI的计算就是这么简单！你也来试试吧。

参考文献：

1.Bohlin J, Skjerve E. Examination of genome homogeneity in prokaryotes using genomic signatures. PLoS One.2009, 4(12) :e8113.

2.Rokas A, Williams B L, King N, et al. Genome-scale approach es to resolving incongruence in molecular phylogenies. Nature. 2003,425 (6960) :798-804.

3.Goris J, Konstantinidis KT, Klappenbach JA, Coenye T, Vandamme P, Tiedje JM.DNA-DNA hybridization values and their relationship to  whole-genome sequence similarities. Int J Syst Evol Micro-biol . 2007;57:81–91. 

4.Guo Y, Ge S. Molecular phylogeny of Oryzeae (Poacese) based on DNA sequences from chloroplast, mitochondrial, and nuclear genomes. American Journal of Botany. 2005, 92  (9) :1548-1558.

5.Wolfe K H, Shields D C . Molecular evidence for an ancient duplication of the entire yeast genome. Nature. 1997, 387 (6634) : 708-712.

6.Comas I, MOYA A., Gonzalez-Candelas F. From phylogenetics  to phylogenomics: the evolutionary relationships of insect endosymbiotic y-Proteobacteria as a test case. Systematic biology 2007,56 (1) : 1-16.

7.Mi H, Dong Q, Muruganujan A, et al. PANTHER VERSION 7: improved phylogenetic trees, orthologs and collaboration with the Gene Ontology Consortium. Nucleic acids research. 2010, 38 (suppl 1) : D204-D210.

8.Chan J Z, Halachev M R, Loman N J, et al. Defining bacterial species in the genomic era：insights from the genus Acinetobacter. BMC microbiology. 2012, 12 (1) :302.

9.Han Y,， Chen F.，Li N, et al. Bacillus marcorestinctum sp.no v.,a novel soil acylhomoserine lactone quorum-sensing signal qu-enching bacterium. International journal of molecular scienc-es. 2010, 11 (2) : 507-520.

10.Pride DT, Meinersmann R J,Wassenaar T M, et al. Evolutionary implications of microbial genome tetranucleotide frequency biases. Genome research. 2003,13 (2) : 145-158.

11. Do Nascimento N C, Santos A P, Guimaraes A M,，et al. Mycoplasma haemocanis-the canine hemopasma and its feline counterpart in  the genomic era. Veterinary research. 2012, 43 (1) : 1-9.

12.Richter M., Rossello-More R. Shifting the genomic gold standard f-or the  prokaryotic species definition, Proceedings of the Nation-al Academy of  Sciences. 2009,106 (45) : 19126-19131.

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