3分钟带你看透环状RNA

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“贫困落后”的过去

环状RNA（circular RNA）是区别于线性RNA 的一类新型环状非编码RNA，目前在人、小鼠、线虫等模式生物中已被大量发现，具有物种保守性和组织特异性。其独特的环状结构使其不容易被RNA 酶降解，因此在细胞内稳定性很强，在新型生物标记、生物学机制研究等方面具有巨大的潜力和研究价值。

其实在30 年前环状RNA 就已经在电子显微镜中被发现，之后一直有陆续报道。但相关报道发现的环状RNA 表达丰度一直很低，所以大家也一直以为这东西是转录的噪音，没有什么实际作用，另外也没有合适的测序技术来大规模分析这些“噪音”。那个时候cirRNA的身份是“卑微”的，这种状态一直持续到2012年。

如火如荼的研究现状

自从2012 年第一篇环状RNA 文章（ Salzman，2012）发表以来，大量目光长远的研究者涌入这个领域，使得环状RNA 的研究成果不断产出。目前研究最多的就是由外显子形成的环状RNA ，这些环状RNA 位于细胞质中，含有大量miRNA 结合位点，可起到miRNA 海绵作用（miRNA sponge），结合并封闭miRNA 的调控作用，从而使其靶基因表达增强。下面我们来看一下目前在外显子环状RNA的一些研究成果。

1环状RNA的生成机制

经典的线性RNA剪切方式：

通过内含子中的GU/AG序列，将前后外显子首尾相连。

环状RNA的剪切方式：

反向剪切，后面外显子的尾端与前面外显子的前端相连。

2环状RNA的稳定性

由于环状RNA 的结构是保守的闭合环状所以可以抵抗核酸外切酶的降解作用，在细胞内比较稳定，half time > 48h。但在血清中非常不稳定，half time 大概是15s。

3环状RNA的功能

A、ceRNA调控方式

B、与蛋白质一起影响mRNA表达NGS技术发现环状RNA原理

通过spliced reads的mapping能发现线性RNA和环状RNA的剪切方式不同。一个是正常的5’/3’前后剪切，一个是反向的5’/3’反向剪切。

建库策略

环状RNA 的建库策略有两种：

普通的lncRNA 建库，即去除样本中的核糖体RNA，然后对线性RNA 和环状RNA 进行测序；环状RNA 的特有的建库方法，去除样本中的核糖体RNA之后进一步消化样本中的线性RNA。

两种建库策略后续分析比较：

普通lncRNA 文库不仅可以检测样本中的环状RNA，还可以一次性检测样本中的其它线性RNA，如mRNA、lncRNA。

其优点体现在：

便于比较环状RNA 和其他类型RNA 的相对丰度；进行共表达分析，分析环状RNA 和其他功能已知的RNA（尤其为mRNA）的相互作用关系，从而推测环状RNA 的功能。

但普通lncRNA 文库测序也存在局限性，主要体现在：

环状RNA 有效数据量低，不易检测到低丰度的环状RNA，因为样本中大部分都是线性RNA；同一基因转录出的线性RNA 会干扰环状RNA 的检测，从而提高了环状RNA 检测的假阳性。

环状RNA建库排除了线性RNA 的干扰，提高数据可靠性和利用率。

不足之处：

建库价格比常规文库高；缺失了样本中的线性RNA信息。

环状RNA 测序的数据量

环状RNA 不仅具有组织特异性，还具有物种特异性。对于环状RNA 未报到的物种，测多少数据量合适，属于探索性的问题，需要根据实际项目摸索。2014 年，Nature biotechnology 的综述文章（William R Jeck，Nature biotech.，2014 ）建议“circRNA analysis requires at least millions of reads, and preferably hundreds of millions, even in libraries with preferential enrichment by RNase R digestion. ”

因此在实际项目中：

如果使用环状RNA 建库的策略，建议测序量不低于6G/样本（植物）；如果采用普通lncRNA 文库，建议植物的测序量不低于12G/样本，动物则推荐16G/样本以上的测序量。

策略选择

那么具体项目，应该选择普通lncRNA 文库还是环状RNA 文库呢？

如果是环状RNA 未报导的物种，建议优先采用环状RNA 建库的策略，以便对环状RNA有更好的检测效率，发现尽可能多的环状RNA。如果是环状RNA 已报导，且认为目标环状RNA 有较高的丰度，同时又特别关心环状RNA 与其他线性RNA 的相互作用关系，则可以考虑使用普通lncRNA 文库的策略。

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