RNA提取的实验步骤及结果剖析

本文详细介绍RNA提取前的实验准备、RNA提取的详细实验步骤，以及对RNA提取结果的剖析。希望可以大家在做克...



本文详细介绍RNA提取前的实验准备、RNA提取的详细实验步骤，以及对RNA提取结果的剖析。希望可以大家在做克隆和荧光定量时有所帮助！注意:RNA提取也做到无菌操作的水平！

实验原理

Trizol内含异硫氰酸胍能迅速破碎细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性并释放出核酸；由于释放出的DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同，且分别位于中间相和水相，从而使DNA和RNA得到分离；取出水相后，通过有机溶剂(氯仿)抽提及异丙醇沉淀，可得到纯净RNA。

预备实验

1.DEPC简介

DEPC是一种潜在的致癌物质，主要是能生成乙酯基衍生物和乙酯类衍生物，其中尿烷是一种已知的致癌物质。DEPC有刺激性，对眼睛和气道粘膜有强刺激，在操作中应尽量在通风的条件下进行，DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩，不小心占到手上注意立即冲洗。由于DEPC是一种酯类，较难溶于水，故通过加热搅拌的方式来使其溶解。
2.1%的DEPC水的制备（1L）

取1mlDEPC于999ml去离子水中，37℃在磁力搅拌器上搅拌4h以上使其溶解。此溶液即1%DEPC水。

注意：

①DEPC与水反应后会产生大量的气体，可用塑料膜将瓶口扎紧，剧烈混匀后通过观察塑料膜是否胀气来判断反应是否充分

②DEPC水的量可以根据需要配制即可，原则上确保所有的物品都能浸在DEPC水中。

③制备的1%DEPC水，应留下100ml左右并装入100ml左右的试剂瓶中，以备溶解RNA用。注意：根据试剂瓶的大小调节所留的DEPC水的量，原则是确保DEPC水能够充满整个试剂瓶，并且盛有DEPC水的试剂瓶也要放置过夜，然后高温高压灭菌使DEPC分解后才能用于溶解RNA。

④配制DEPC处理水时用棕色瓶。

3.离心管、各种大小的枪头（1000ul、200/100ul、10ul）根据步骤及提取的量计算所需的个数，然后用制好的1%DEPC浸泡比计算数目略多的过夜处理。

注意①处理方法：用镊子夹住离心管，然后浸入DEPC水中，使离心管中充满液体，然后再倒出，反复2次，最后一次再浸入DEPC水后直接浸入其中，无需倒出。而枪头则用最大量程的枪吸打DEPC水2次，最后一次吸入后不再打出，直接把枪头推至DEPC水中。

②处理完毕后，离心管一般用一培养瓶盛装，枪头用枪头盒盛装，故DEPC处理时也应包含这些器皿。

4.研钵、研棒、试剂瓶、镊子、废液瓶等用锡箔纸包好口后200℃干热灭菌4h。

5.RNA酶的来源。大量的微生物存在于空气中、水中及物体的表面，当它们死亡时，会释放大量的RNAase。对于人的皮肤、粘液、唾液等都因为直接或间接的与空气接触而携带有RNAase。

实验步骤

主要参见trizol试剂的说明书，以下步骤仅供参考。

(1)取离心管做好标记，0.2g样品液氮研磨成粉末状，加1mlTrizol，漩涡混匀，室温静置5min。

可提前将离心管放液氮凉一会；一定要将材料研磨充分，且一旦研磨完毕立刻加入Trizol混匀。这一步是能否提出RNA的关键。

(2)加200µl氯仿，上下颠倒15s，室温静置3min。

提前打开冷冻离心机，若在夏季进行实验需开启制冷开关。

(3)12000 r/min 4℃离心15min。

(4)取离心管，样品分三层(无色上清水相，中间白色层，粉色下层有机层)小心吸取无色上清至另一新离心管。

收集上清时应调小枪头（50ul即可），缓慢吸取。

(5)加入等体积异丙醇，轻轻混匀，冰浴10-20min。

这段时间可以用灭菌处理的DEPC水配制75%乙醇。

(6)弃上清，用75%乙醇1ml悬浮沉淀。

(7)12000 r/min 4℃离心10min。

离心之前一定要悬浮沉淀，即指用移液枪将沉淀打起。

(8)弃上清，再短暂离心，用移液枪将残余的乙醇吸出，沉淀于室温下晾干。

晾干的标准是无酒精味即可。

(9)加入30-50µlDEPC处理的水溶解RNA。

提取完毕后分出2管，其中一管装2ulRNA，用于浓度的测定；另一管装2—5ul，用于电泳检测。浓度测完后根据反转录的要求分装小管，保证每一管符合反转录反应所需的RNA的质量。若用于半定量，则必须保证各样品每管的质量均相同。

（10）电泳时用3%H2O2对电泳整个装置消毒。

（11）取1—2ul进行电泳检测及浓度检测。

（12）分装，-80℃保存。

注意事项

1.      氯仿、异丙醇、乙醇都应用未开封的，75%的乙醇用移液枪配制，勿用量筒等中间器皿。

2.      整个过程要及时更换手套，戴双层口罩，并在操作区开启酒精灯。

3.      RNA一定要贮存到-70℃冰箱，在-20℃保存时间很短。

4.      配制的溶液应用灭菌处理的DEPC水。

5. 移液器： RNase的又一污染源是移液器。根据移液器制造商的要求对移液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗移液器的内部和外部，基本达到要求。RNA提取，对于整个分子生物学实验来说，算是比较有难度的操作了，提取出RNA如何判断质量的好坏呢？那当然通过电泳图了。下面将揭晓电泳图上的秘密，帮助您更好的来提取RNA，提高成功概率。

1. RNA条带不亮或缺失

（1）上样量不足。

（2）染色剂不足或染色剂分布不均匀。

（3）RNA跑出凝胶。电泳至溴酚蓝至凝胶的2/3即可停止电泳。另外电泳槽应水平放置，缓冲液要浸过凝胶，

（4）RNA在凝胶中发生扩散。避免长时间的电泳，否则小片段容易扩散。

（5）RNA降解。最大限度减少在紫外线下暴露的时间，使用新鲜的电泳缓冲液，新制的凝胶，电泳槽及制胶的模具梳子等用双氧水浸泡，高电压短时间电泳（20min）。也可能使用的组织材料不够新鲜（冷冻的材料必须在化冻之前将其磨碎）。

2. RNA条带弥散

（1）RNA被核酸酶降解。要用新的缓冲液，制胶用的模具要清洁，枪头要灭菌。

（2）电泳条件不适合。避免长时间电泳，缓冲液要浸过凝胶，电压要合适，不能过低。电压过高，造成电流过大，也容易引起此现象的发生。一般5—8V/cm.（聚丙烯酰胺电泳多采用8V/cm）所以计算采用电压时应先测量电泳槽两电极之间的距离。为了增加条带的清晰度，电泳开始的几分钟建议使用低电压。

（3）上样量过大。根据沉淀量的多少确定点样的量，一般1—3ul。

（4）胶孔不规则。插梳子时应垂直插入，凝固后拔出梳子。

3. 背景很高

（1）核酸染剂加入的量过多。应按说明书添加。

4. 点样孔发亮

（1）上样量过大。

（2）胶孔未凝固好，使样品无法往前移动。

（3）RNA样品中含有污染物，如残留的蛋白质容易引起此现象。可能trizol量太少，应加大trizol用量。另外若残留DNA也应考虑加大trizol用量。

5. 出现多条带

（1）RNA降解。提取过程中出现降解或电泳过程中出现降解（可能性较小）。

（2）上样量过大。RNA由多种类型组成，若上样量过大则会导致各种类型的RNA（tRNA，mRNA等）均会出现条带。

提取常见问题

1.研磨必须要充分，样品用量要严格。

2.处理的枪头离心管要量少多份，无RNAase的DEPC水也要量少多份，以备分装RNA和调浓度使用。

3.电泳时间10-20min，不宜过长，电压可为120-130V。

4.点样用的10ul枪头也要提前处理。

5.枪头离心管90℃烘干5——6h。

6.电泳时，可以点样Marker作阳性对照。

7.从-70℃冰箱中取出材料要在解冻之前迅速研磨。

8.提出的RNA可在70%酒精-70℃保存一年。

9.所有的东西必须有多余，防止出现用品的损失。

10.试剂瓶可以连续使用。

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