浅谈NgAgo介导的基因编辑及其实验步骤
浅谈NgAgo/gDNA介导的基因编辑自从Cas9用于基因编辑技术以来，其廉价、方便、高特异性...
浅谈NgAgo/gDNA介导的基因编辑
自从Cas9用于基因编辑技术以来，其廉价、方便、高特异性的优点让其他的基因编辑技术望而止步，其在疾病治疗领域的作用更让其大放光彩，Cas9从此独步天下。武林至尊，宝刀cas9，号令天下，莫敢不从，倚天不出，谁与争锋。
现在倚天剑出世了，它便是NgAgo。该技术利用嗜盐碱杆菌属的Argonaute（一类庞大的蛋白质家族）来实现DNA引导的基因组编辑。该技术的问世跟科研界带来诸多震撼：
首先，该技术的有诸多优点。该技术通过gDNA来引导内切酶的切割，可以外源转入细胞，而不是利用gRNA的Cas9，这样操作更容易；靶序列不需要Cas9所需的PAM序列，因而其可以切割任何序列，应用更广泛；DNA-DNA的结合要比DNA-RNA的结合更稳定，因此该技术的特异性要比Cas9高；该技术利用的5’磷酸化的单链DNA，这种形式的DNA在哺乳动物中非常罕见；NgAgo的氨基酸数目只有Cas9的 2/3 ；NgAgo的gDNA只有24个碱基，比Cas9的gRNA要简单的多；NgAgo在切除DNA时会同时去掉几个碱基；NgAgo也具有非常高的特异性。拥有诸多优点的NgAgo，自然可以发表在日的顶级学术杂志《自然生物技术》上，该杂志影响因子为41.5。
其次，如果我们看一下这篇文章的单位，可以发现是河北科技大学，这所既非985也不是211的中国一般大学因为这项技术而在一夜之间让世界备受瞩目。
再次，这篇文章的作者韩春雨，也许是这篇文章最让大家震撼的地方。1996年本科毕业于河北师范大学 生物系，之后在中国农业科学院攻读硕士，在中国协和医科大学/中国医学科学院攻读博士。这样一位没有海外学术经历的毕业于中国一般大学的中国科学家在有限的资源下却做出了让世界瞩目的成就。
现在倚天剑出世了，它便是NgAgo。该技术利用嗜盐碱杆菌属的Argonaute（一类庞大的蛋白质家族）来实现DNA引导的基因组编辑。该技术的问世跟科研界带来诸多震撼：
首先，该技术的有诸多优点。该技术通过gDNA来引导内切酶的切割，可以外源转入细胞，而不是利用gRNA的Cas9，这样操作更容易；靶序列不需要Cas9所需的PAM序列，因而其可以切割任何序列，应用更广泛；DNA-DNA的结合要比DNA-RNA的结合更稳定，因此该技术的特异性要比Cas9高；该技术利用的5’磷酸化的单链DNA，这种形式的DNA在哺乳动物中非常罕见；NgAgo的氨基酸数目只有Cas9的 2/3 ；NgAgo的gDNA只有24个碱基，比Cas9的gRNA要简单的多；NgAgo在切除DNA时会同时去掉几个碱基；NgAgo也具有非常高的特异性。拥有诸多优点的NgAgo，自然可以发表在日的顶级学术杂志《自然生物技术》上，该杂志影响因子为41.5。
其次，如果我们看一下这篇文章的单位，可以发现是河北科技大学，这所既非985也不是211的中国一般大学因为这项技术而在一夜之间让世界备受瞩目。
再次，这篇文章的作者韩春雨，也许是这篇文章最让大家震撼的地方。1996年本科毕业于河北师范大学 生物系，之后在中国农业科学院攻读硕士，在中国协和医科大学/中国医学科学院攻读博士。这样一位没有海外学术经历的毕业于中国一般大学的中国科学家在有限的资源下却做出了让世界瞩目的成就。
NgAgo/gDNA介导的基因编辑实验步骤
1. 根据所需基因敲出的基因选择靶序列：靶序列在基因组中应该仅存在于靶基因中，位点在编码的mRNA的5’端附近或者在关键结构域的位置，长度在24个碱基左右，靶序列与其他非靶序列最好有至少3个碱基错配。
2. 根据靶序列合成对应的5’P单链DNA.
3. 细胞转染：200-250 ng NLS-NgAgo plasmid (100 ng/μl in 0.5x TE buffer (5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA，pH 8.0) 和100-300 ng guides （100 ng/μl in 0.5x TE buffer (PH 8.0).）溶解在50 μl Opti-MEM (Gibco)。对于24孔板，1.25 μl lipofectamine 2000 稀释在50 μl Opti-MEM，放置20min。然后和细胞混合。
4. 提取基因组DNA: 转染后48 -60小时，收获细胞，用胰蛋白酶处理，四孔的细胞收集在1.5ml的管子里；每个管子加入500 μl of cell lysate buffer (50 mM Tris，100 mM EDTA，0.5% SDS，pH 8) and 10 μl proteinase K (10 mg/ml），55℃ 放置2 hours；每管加入200 μl Tris-Phenol 和 200 ul trichloromethane ，温和混匀，放置5 min， 12,000 rpm 离心15 min ，收集水相于另一干净的离心管；每管加入200 μl Tris-Phenol 和 200 ul trichloromethane ，温和混匀，放置5 min， 12,000 rpm 离心15 min ，收集水相于另一干净的离心管；每管加入500 μl trichloromethane，温和混匀，放置5min，12,000 rpm 离心15 min ，收集水相于另一干净的离心管；每管加入500 μl trichloromethane，温和混匀，放置5min，12,000 rpm 离心15 min ，收集水相于另一干净的离心管；每管加入900 μl EtOH，-20°C 放置30 min， 12,000 rpm 离心10 min，沉淀用500 μl 75% EtOH 洗三次，晾干DNA,然后加入50 μl 0.5 x TE 并调整DNA浓度到100 ng/μl。
5. PCR 扩增靶点附近序列
Genomic DNA 1 μl， Primer 1: (10 umol/ μl） 0.5 μl，Primer 2: (10 umol/ μl） 0.5 μl，2 x Taq PCR starmix with loading dye（GenStar） 10 μl，H2O 8 μl
PCR program：
96℃ 3min；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 20s (30 cycles）；72℃ 5min
6. 测序PCR产物，观察突变结果。
参考文献：.
Chunyu Han, et al. DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute. 《nature biotechnology》
2. 根据靶序列合成对应的5’P单链DNA.
3. 细胞转染：200-250 ng NLS-NgAgo plasmid (100 ng/μl in 0.5x TE buffer (5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA，pH 8.0) 和100-300 ng guides （100 ng/μl in 0.5x TE buffer (PH 8.0).）溶解在50 μl Opti-MEM (Gibco)。对于24孔板，1.25 μl lipofectamine 2000 稀释在50 μl Opti-MEM，放置20min。然后和细胞混合。
4. 提取基因组DNA: 转染后48 -60小时，收获细胞，用胰蛋白酶处理，四孔的细胞收集在1.5ml的管子里；每个管子加入500 μl of cell lysate buffer (50 mM Tris，100 mM EDTA，0.5% SDS，pH 8) and 10 μl proteinase K (10 mg/ml），55℃ 放置2 hours；每管加入200 μl Tris-Phenol 和 200 ul trichloromethane ，温和混匀，放置5 min， 12,000 rpm 离心15 min ，收集水相于另一干净的离心管；每管加入200 μl Tris-Phenol 和 200 ul trichloromethane ，温和混匀，放置5 min， 12,000 rpm 离心15 min ，收集水相于另一干净的离心管；每管加入500 μl trichloromethane，温和混匀，放置5min，12,000 rpm 离心15 min ，收集水相于另一干净的离心管；每管加入500 μl trichloromethane，温和混匀，放置5min，12,000 rpm 离心15 min ，收集水相于另一干净的离心管；每管加入900 μl EtOH，-20°C 放置30 min， 12,000 rpm 离心10 min，沉淀用500 μl 75% EtOH 洗三次，晾干DNA,然后加入50 μl 0.5 x TE 并调整DNA浓度到100 ng/μl。
5. PCR 扩增靶点附近序列
Genomic DNA 1 μl， Primer 1: (10 umol/ μl） 0.5 μl，Primer 2: (10 umol/ μl） 0.5 μl，2 x Taq PCR starmix with loading dye（GenStar） 10 μl，H2O 8 μl
PCR program：
96℃ 3min；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 20s (30 cycles）；72℃ 5min
6. 测序PCR产物，观察突变结果。
参考文献：.
Chunyu Han, et al. DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute. 《nature biotechnology》
我们正在研究该技术，如果有兴趣合作的朋友请与我们联系
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