CNS推荐：格雷格亲述低氧诱导因子被发现的故事

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作者：解螺旋.大厨

如需转载请注明来源：解螺旋·医生科研助手

“格雷格，我们肯定会要你的，放心吧”，这是我在寻找博士后职位时，约翰霍普金斯大学的海哥这样对我说的，带着这一承诺，1986年的夏天，我收拾行囊，开着租来的搬家小皮卡，从北卡一路开到巴尔的摩。

之前，我是杜克医院的实习生，在第三年的时候，我决定先进行儿科培训，然后再学习医学遗传学。为此，霍普金斯成了我的首选，因为这里是现代医学遗传学之父维克多的老家，此外还有海哥和史泰龙等一众牛人，他们曾与司徒安特在哈佛的时候，就β-地中海贫血做出了杰出的工作，这一课题也是我的博士论文题目。后来，史泰龙成了我的二老板。

当时，转基因小鼠刚刚兴起，我初步决定利用这一前沿技术研究基因表达，而海哥和史泰龙却对引起血友病A的因子8基因突变感兴趣。为了迎合老板们的口味，我就联系了遗传所的强克，他已经克隆了因子8基因，看看他是否能够给我一点基因组克隆。虽然一开始他答应好好的可以给我，但是后来却建议我考虑研究另一个已经被他克隆好的基因，这就是EPO。

EPO，即红细胞生成素，主要在胚胎期肝脏和成年期肾脏产生，并分泌至血浆之中，可以通过结合骨髓中红细胞祖细胞来调控血液中红细胞的数量。肾衰竭的病人无法产生EPO，从而导致贫血，虽然可以通过输血得以缓解，但是也为肝炎的发生带来了可能。克隆并研究EPO基因，就有可能生产人工合成的EPO蛋白，为肾衰病人带来新的希望。

我起初的兴趣点在于发育过程中，为什么EPO的合成从胎儿肝脏转移到了成年肾脏？推测的结果可能是这个基因具有多个不同的增强子，并负责该基因在不同组织表达；但是，EPO基因表达还受到生理调控。这些都为该基因的研究带来了重重挑战。由于我自己对于转基因小鼠一窍不懂，就拉了生理系的约翰教授来帮忙合作。很快，我们有了EPO转基因小鼠，并且小鼠表型也和我们的预期一致，无论是转人源还是鼠源EPO，都能产生过多的血红细胞。进一步通过设计具有不同DNA长度片段的转基因小鼠，验证了最初的想法。EPO在肝脏和肾脏等不同组织的差异表达主要受到该基因3’和5’区域调控。在解决了发育调控这个问题之后，我们下一步的目的就是试图回答该基因生理调控的机制。

我们知道红细胞的主要功能在于运载氧气，当我们身处于低氧环境中，低氧可以刺激EPO产生，而不改变红细胞数目。为了利用哈罗德几年前开展的核酸酶超敏实验，寻找调控EPO表达的瞬式作用元件，我将EPO转基因小鼠来源的肝脏细胞细胞核提取出来，发现人源EPO转基因的超敏点在于3’端。而这一段序列正好囊括了低氧应激片段（HRE），即一段可以调控不同报告基因转录活性的序列。

到这里，我们进一步猜想，有一种反式作用元件通过结合HRE可以激活EPO转录。因此，我们展开了一系列的“电泳迁移”实验，在该实验中，利用同位素标记包含有HRE片段的DNA双链，据此，希望能够找到响应低氧应激并结合到该序列的蛋白质。这些实验的细节都需要非常的注意，因为非特异性结合的蛋白质必须被去除，否则无法分析，然而，不同蛋白质结合DNA的最佳盐浓度都是非常特异的。当然，也有另外的可能性（我凝视最暗黑的物体，让思绪神驰），这一因子很可能在任何条件下都会结合，只要在低氧下被激活。之后，我的身份升级为课题组长，并招收了我的第一个博士后王光。他每一天都重复着凝胶迁移实验，尝试不同的盐浓度和DNA载体等，但是每一次都是阴性结果：结合情况在低氧条件和对照组之间并没有区别。然后，数周之后，王光在他的桌子上摆放着一个令人印象十分深刻的显影图，每一个条带都显示着非常美丽的迁移。

第一天看到这个结果的时候，我十分震惊。拿着这些显影后的蓝色塑料胶片，对着荧光灯，一个接一个的仔细检查，努力寻找低氧和对照组之间的区别，直到我发现有一条条带发生略微迁移。我按捺不住惊喜，对王光大喊道“你看见了么？你看见了么？”，真真的没想到这一实验结果被埋藏的如此之深。带着激动和忐忑，王光开始了新的一轮重复实验，通过优化条件，仅仅在一周之内，他获得了令人更佳信服的实验结果----一条清晰的迁移条带。进一步发现，采用干扰HRE片段的核酸替代物可以阻滞该迁移条带的产生，即阻止DNA和蛋白质的结合。这就是我们一直苦苦寻找的因子，我们将其命名为具有DNA结合活性的低氧诱导因子-1（HIF-1）。紧接着，我们的任务就是对这一DNA结合蛋白质的特性进行鉴定。正巧，隔壁小镇卡内基研究所的史蒂夫开发了一种技术，通过利用重组噬菌体表达哺乳动物cDNA以及放射性寡核苷酸筛选技术，检测能够与探针相结合的蛋白质。与他们合作，我们筛选了成千上万的噬菌体，然后，很不幸的是一无所获。至此，我们意识到目前摆在我们面前只有三条路：一是继续筛选，很可能仍旧什么都拿不到；二是可以尝试采用生化方法纯化HIF-1；三是放弃对于HIF-1的鉴定，等待别人去完成这一工作。然而，第一个和第三个选项都不是我们想要的，那么只剩下第二个选择了。但是，这对于我们来说是完全陌生的领域，在当时条件下，类似我们这样的小分子遗传学实验几乎无法完成这样一个庞大的项目。

值得庆幸的是，我当时获得了来自马克慈善基金会的资助，除此之外，让我欣喜的是，每年所有的基金获得者都会聚在一起，开个年会啥的。那一年，乔做了一个令人印象深刻的晚宴致辞，其中，他强调了在我们追寻问题答案的时候，需要一种“技术上的勇气”，即便这些技术不是我们自己所擅长的，这些话给了我很大的鼓舞。

更为幸运的是，对于当时进退两难的我，认识了霍普金斯分子生物学与遗传学系的汤姆，他是第一个纯化与DNA相结合蛋白质的分子生物学家。他和他的实验室成员都非常慷慨和热情，对我们共享了很多他们的技术和仪器。在预实验中，我们对于野生型和突变型寡核苷酸型的细胞核提取物进行了DNA亲和层析实验，初步实验数据表明有两个多肽共同与我们的靶向DNA序列相结合，我们分别称之为HIF-1α和HIF-1β。由此可见，这个蛋白是一个异二聚体，如果采用我们之前的噬菌体表达单个多肽的筛选法，将会死无葬身之地。

当时，我们已经发现所有的哺乳动物细胞都可以找到HIF-1，因此，我们扩大纯化体系，以便获得足够量的HIF-1α和HIF-1β，请维斯塔研究所的大卫实验室帮我们进行测序分析。在1995年，蛋白质测序数据库还十分有限。即便如此，当我们第一时间从费城拿到测序结果，来自肺和重症监护医学的同事查理意识到这一蛋白质的重要性，迅速的帮我们进行了蛋白质序列的比对检索。没过多久，他就挥舞着一张打印了星星点点的纸，跑来问我们：“有谁听过ARNT？”我们之前自称为HIF-1β的序列似乎和这个东西（最早由奥利弗发现）一模一样，也就是说，HIF-1β既可以与ARNT蛋白结合，也可以与HIF-1α结合。

另一方面，HIF-1α的肽段序列在数据库中没有任何可以匹配的信息，因此，我们换了一个方法，准备将寡核苷酸降解后，与来自于低氧细胞的mRNA所形成的cDNA文库进行比对。皮特实验室帮忙进行了全部工作并提供了无比宝贵的建议。数月之后，我们成功克隆了HIF-1α的cDNA。

我们将获得的cDNAs送给世界各地的实验室，有关HIFs功能的研究很快就遍地开花，囊括了发育生物学、生理学、医学以及进化学等。时至今日，HIF研究的车轮已经完整地旋转一圈，已经进行的临床试验也表明通过激活HIF活性，刺激红细胞生成的药物，可以缓解肾衰病人对于EPO注射的长期依赖。我在霍普金斯工作也满30周年了，在这里，心怀海哥当年对我说的那句话：“我不会让你失望的”，我也有幸指导了众多的学生、博士后和年轻职工。

大厨点评一二：

大厨本人很喜欢读人物传记，尤其是科学家讲述他们的伟大发现背后不为人知的故事，或精彩绝伦，或平平淡淡，点点滴滴的细节都会告诉我们每一个记入史册的科学是如何产生的，为我们自己的工作带来或多或少的些许启发。

原文链接：http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(16)31142-4精彩内容回顾（回复左边数字查看）：

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